本文選題：肺癌 + 恩度　； 參考：《山東大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移都與腫瘤的的血管新生密不可分,因此抑制腫瘤的血管新生是控制腫瘤生長的新熱點(diǎn)。重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度,Endostar)是通過抑制血管生長起抗腫瘤作用的一種藥物。研究證實(shí)單獨(dú)應(yīng)用抗血管新生藥物不能帶來長期的生存獲益,而聯(lián)合細(xì)胞免疫治療可能獲得持續(xù)性的腫瘤消退,這提示抗血管新生藥物與細(xì)胞免疫治療有協(xié)同效應(yīng)。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells, APCs),在調(diào)控機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起重要的作用,負(fù)載腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞是近年來被廣泛研究生物治療之一。本實(shí)驗(yàn)通過C57BL/6小鼠Lewis肺癌荷瘤模型,研究恩度聯(lián)合負(fù)載mut1抗原特異的DC-T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)及對腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫網(wǎng)絡(luò)的影響,進(jìn)一步明確恩度聯(lián)合細(xì)胞免疫治療的抗腫瘤效應(yīng),從而為開展抗血管新生的分子靶向治療與細(xì)胞免疫治療的聯(lián)合提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法1.培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞：顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和數(shù)量,及時(shí)換液和傳代,待細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)期后,用于實(shí)驗(yàn)。2.制備負(fù)載mut1抗原多肽的DC-T細(xì)胞：分離及培養(yǎng)小鼠脾T淋巴細(xì)胞,分離及培養(yǎng)小鼠來源的樹突狀細(xì)胞,負(fù)載mut1抗原多肽的樹突狀細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)制備mut1抗原特異性的DC-T細(xì)胞。3.構(gòu)建C57BL/6小鼠Lewis肺癌皮下種植瘤模型并分組：將C57BL/6小鼠荷瘤后隨機(jī)分為A組(PBS對照組)、B組(DC-T組)及C組(DC-T+恩度組)。荷瘤后第7天開始給予治療干預(yù)：A組給予尾靜脈注射PBS溶液,B組及C組給予尾靜脈輸注負(fù)載mutl抗原肽DC-T細(xì)胞,C組給予尾靜脈注射恩度(重組人血管內(nèi)皮抑素)。4.腫瘤生長情況及抑瘤率的測定：荷瘤后隔日測量各組小鼠體質(zhì)量及移植瘤的最大長徑和短徑,計(jì)算腫瘤體積并繪制生長曲線；末次干預(yù)24小時(shí)后處死小鼠,解剖出腫瘤組織稱其體質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率。5.免疫組化SP法檢測各組腫瘤組織微血管密度(MVD)。6.Western blotting檢測各組腫瘤組織中VEGF-A 和 HIF-1α的表達(dá)。7.流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織中MDSC、TAM (M1/M2)、mDC和CD8+T細(xì)胞的比例。結(jié)果1.與A組相比,B組及C組小鼠體質(zhì)量及腫瘤體積增長緩慢,B組腫瘤質(zhì)量小于A組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),抑瘤率為25%；C組腫瘤質(zhì)量明顯小于A組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),抑瘤率為52%。2.MVD計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果示B組與A組相比MVD計(jì)數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；C組與A組相比MVD計(jì)數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3.Western blotting結(jié)果顯示,與A組相比,B組(P0.05)及C組(P0.01)腫瘤組織內(nèi)的VEGF-A蛋白表達(dá)水平下降,HIF-1 α蛋白表達(dá)水平增加4.流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,與A組相比,B組(P0.05)及C組(P0.01)腫瘤微環(huán)境中MDSC和M2型TAM比例下降,M1型TAM升高,mDC和CD8+T細(xì)胞比例增加。結(jié)論恩度聯(lián)合負(fù)載mut1抗原多肽的DC-T細(xì)胞治療可有效抑制腫瘤血管新生,明顯減緩腫瘤生長,加劇腫瘤組織內(nèi)的低氧,有效逆轉(zhuǎn)了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制,從而發(fā)揮了協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。
[Abstract]:Objective the occurrence, invasion and metastasis of tumor are closely related to neovascularization of tumor. Therefore, inhibition of angiogenesis is a new hot spot to control tumor growth. Recombinant human endostatin (Endostar) is a drug that inhibits angiogenesis by inhibiting the growth of blood vessels. Dendritic cells (DCs) is the most functional antigen presenting cell (antigen-presenting cells, APCs), which regulates the inherent and inherent characteristics of the body, which is the most functional antigen presenting cell (antigen-presenting cells, APCs). The adaptive immune response plays an important role. Dendritic cells loaded with tumor antigen are one of the most widely studied biological treatments in recent years. In this experiment, the anti-tumor effect of C57BL/6 specific DC-T cells loaded with Mut1 antigen and the effect on the immune network within the tumor microloop were studied by the Lewis tumor bearing tumor model of the mice. One step is to clarify the anti tumor effect of the combination of degree of grace and cell immunotherapy, so as to provide experimental basis and theoretical basis for the combination of anti angiogenic molecular targeting therapy and cell immunotherapy. Method 1. Lewis lung cancer cells were cultured. Under the microscope, the state and quantity of cells were observed and the liquid and passages were changed in time, and the cell growth entered the logarithm. DC-T cells loaded with Mut1 antigen peptides were prepared by.2.: isolation and culture of mouse spleen T lymphocytes, isolation and culture of dendritic cells from mice, dendritic cells with Mut1 antigen peptide and T lymphocyte co culture to prepare Mut1 antigen specific DC-T cells in.3. construction of C57BL/6 mouse Lewis lung cancer subcutaneous implantation The tumor model was divided into groups: C57BL/6 mice were randomly divided into A group (PBS control group), group B (group DC-T) and group C (DC-T+ group). The treatment intervention was given seventh days after the tumor. A group was given the tail vein injection PBS solution, B and C groups were given tail vein infusion of the load MutL antipropeptide cells, and the group was given the tail vein injection Grace (recombinant human blood). The growth and tumor suppressor rate of.4. tumor were measured: the mass of the mice and the maximum diameter and short diameter of the transplanted tumor were measured every day after the tumor. The tumor volume was calculated and the growth curve was plotted. After the last intervention 24 hours, the mice were killed and the tumor tissue was dissected and the tumor suppressor rate was measured by the.5. immunohistochemical SP method. Tumor tissue microvessel density (MVD).6.Western blotting was used to detect the expression of VEGF-A and HIF-1 a in the tumor tissues..7. flow cytometry was used to detect the proportion of MDSC, TAM (M1/M2), mDC and CD8+T cells in tumor tissues. Results 1. compared with the A group, the mass and tumor volume of the mice increased slowly. The difference was statistically significant (P0.05), the tumor suppressor rate was 25%, and the tumor quality of group C was significantly smaller than that of group A, the difference was statistically significant (P0.01). The tumor inhibition rate was 52%.2.MVD count statistics showed that the MVD count decreased in B group and A group, and the difference was statistically significant (P0.05); C group and A group were significantly less than those in A group, and the difference was statistically significant. (P0.01).3.Western blotting results showed that the level of VEGF-A protein expression in B group (P0.05) and C group (P0.01) decreased, and the expression level of HIF-1 alpha protein increased by 4. flow cytometry. The proportion of CD8+T cells increased. Conclusion the combination of DC-T cell therapy with Mut1 antigen with the combination of grace and load can effectively inhibit tumor angiogenesis, significantly slow down the growth of tumor, aggravate the hypoxia in tumor tissue, effectively reverse the immunosuppression of tumor microenvironment, and thus play a synergistic antitumor effect.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：1912338