本文選題：Notch1 + JAG1�。� 參考：《武漢大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分乳腺癌中Notch1與JAG1基因甲基化狀態(tài)與其發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系目的：Notch1及其配體JAG 1基因甲基化在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能起重要作用。本研究旨在探討Notch1和JAG 1基因甲基化在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)病中的作用。方法：本研究運(yùn)用MassArray檢測(cè)Notch1及其配體JAG1甲基化狀態(tài)在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC；n=96)、乳腺導(dǎo)管原位癌(DCIS；n=33)、不典型乳腺導(dǎo)管增生癥(ADH；n=33)以及普通型乳腺導(dǎo)管增生癥(UDH；n=33)中的改變。運(yùn)用SP免疫組化法測(cè)定這4種乳腺組織中Notch1及其配體JAG1蛋白的表達(dá)。結(jié)果：(1)Notch1蛋白在乳腺IDC和DCIS中的陽(yáng)性率分別為91.7%(88/96)和72.7%(24/33),兩者的表達(dá)均高于ADH組36.4%(12/33)和UDH組(24.2%,8/33),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在IDC組中Notch1蛋白表達(dá)越高則乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越顯著、病理學(xué)分級(jí)越高和TNM分期越晚,其關(guān)系為正相關(guān)(P0.05)。Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG_3、CpG_4.5、CpG_8位點(diǎn)的平均甲基化率IDC組低于DCIS、ADH和UDH組(P0.0083)。乳腺癌組織中Notch1基因CpG_4.5、CpG_10.11、CpG_13.14、CpG_16位點(diǎn)的平均甲基化水平在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌區(qū)域淋巴結(jié)陰性組高于區(qū)域淋巴結(jié)陽(yáng)性轉(zhuǎn)移組(P0.05)；在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌不同TNM分期中CpG_7、CpG_8、CpG_13.、CpG_18位點(diǎn)的平均甲基化水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Ⅲ期Ⅱ期Ⅰ期(P0.001)；在不同組織病理學(xué)分級(jí)中Notch1基因的啟動(dòng)子區(qū)域中CpG_3、CpG_8、Cp G_11.12位點(diǎn)的平均甲基化水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Ⅲ級(jí)Ⅱ級(jí)Ⅰ級(jí)(P0.05)；CpG_3、CpG_8、CpG_13.14.、CpG_16位點(diǎn)的平均甲基化率在ER+PR+C-erbB-2-組低于ER-PR-C-erbB-2+組(P0.05)。(2)JAG1蛋白在乳腺IDC和DCIS中的陽(yáng)性率分別為86.5%(83/96)和75.8%(25/33),兩者的表達(dá)率均高于ADH組(45.5%,15/33)和UDH組(27.3%,9/33),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在IDC組中JAG1基因蛋白表達(dá)水平與乳腺癌的淋巴結(jié)有否轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分級(jí)和TNM分期均呈正相關(guān)(P0.05)。JAG1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG_2、CpG_6、Cp G_13、CpG_20.21.22、CpG_23.24.25、CpG_26位點(diǎn)在IDC組中的平均甲基化率低于UDH、ADH、DCIS組(P0.0083)。浸潤(rùn)性乳腺癌組織中JAG_1基因中CpG_5、CpG_15、CpG_18位點(diǎn)的平均甲基化狀態(tài)在有無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中在乳腺癌區(qū)域淋巴結(jié)陽(yáng)性轉(zhuǎn)移組低于區(qū)域淋巴結(jié)陰性轉(zhuǎn)移組(P0.05)；在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌TNM不同分期間CpG_3、CpG_6、CpG_10、CPG_29.30位點(diǎn)的平均甲基化狀態(tài)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Ⅲ期Ⅱ期Ⅰ期(P0.05)。在病理學(xué)分級(jí)中JAG1基因的啟動(dòng)子區(qū)域中CpG_11.12、CpG_14、CpG_27位點(diǎn)的平均甲基化水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Ⅲ級(jí)Ⅱ級(jí)Ⅰ級(jí)(P0.05)。同時(shí)在乳腺癌受體中CpG_8.9、CpG_17、CpG_27位點(diǎn)的平均甲基化狀態(tài)在ER+PR+C-erbB-2-組高于C-erbB-2+組(P0.05)。結(jié)論：Notchl及其配體JAGl在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中存在廣泛的低甲基化狀態(tài),但他們的蛋白表達(dá)水平顯著升高。Notchl及其配體JAG1甲基化狀態(tài)和它們蛋白表達(dá)呈負(fù)性相關(guān),其表明Notchl及其配體JAGl的廣泛低甲基化也許導(dǎo)致其蛋白表達(dá)增強(qiáng),這種負(fù)性相關(guān)也許是導(dǎo)致乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)生發(fā)展的重要原因。Notchl基因中CpG_3、CpG_4.5、CpG_8位點(diǎn)和JAG1基因中CpG_2、CpG_6、Cp G_13、CpG_20.21.22、CpG_26、CpG_29多個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)降低與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)生顯著相關(guān),提示該兩種基因特定CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)降低也許參加了乳腺組織從良性病變向惡性改變的發(fā)展演變各階段。第二部分 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中miR-203和Notch1基因的表達(dá)及臨床病理關(guān)系目的：檢測(cè)miR-203和Notch1基因mRNA及其蛋白在浸潤(rùn)性乳腺導(dǎo)管癌及增生性乳腺病變中的表達(dá),探討其在浸潤(rùn)性乳腺導(dǎo)管癌和增生性乳腺病變中的作用和臨床病理特征的關(guān)系。方法：應(yīng)用一步法RT-PCR檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)及癌旁組織各60例新鮮標(biāo)本中miR-203、Notch1的mRNA表達(dá)；同時(shí)采用免疫組化SP法檢測(cè)96例石蠟包埋乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、99例乳腺增生性病變和22例正常乳腺組織中Notch1蛋白的表達(dá),并結(jié)合乳腺癌中ER、PR與C-erbB-2蛋白表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果：1.RT-PCR結(jié)果顯示：(1)miR-203在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌60例和癌旁組織60例中的表達(dá)水平分別為12%、89%,在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及相應(yīng)正常乳腺組織中miR-203的表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(P0.05)；Notch1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及相應(yīng)的癌旁組織中表達(dá)水平分別是95.2%、39.1%,其差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中：miR-203表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)顯示陽(yáng)性組顯著低于陰性組,NoN1N2期,miR-203表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)中位數(shù)分別為1.76、0.58和1.05；Notch1基因mRNA表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)顯示陽(yáng)性組顯著高于陰性組,NoN1N2期,Notch1表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)中位數(shù)分別為0.56、1.08和2.12。(3)臨床TNM分期：miR-203表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)中位數(shù)在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期各為1.89、1.10、0.53。兩兩比較顯示Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；Notch1表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化中位數(shù)在Ⅰ期為1.89、Ⅱ期為1.10和Ⅲ期為0.53。兩兩比較顯示Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期(P0.01)。(4)組織學(xué)分級(jí)中：miR-203mRNA在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)中位數(shù)為1.14、0.81和0.54,Ⅰ級(jí)Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)(P0.05)；Notch1mRNA在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)中位數(shù)Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)為10.43、0.77和1.32,Ⅰ級(jí)Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)(P0.05)。(5)ER、PR和C-erbB-2表達(dá)的關(guān)系：miR-203基因mRNA在ER、PR、C-erbB-2(-)、(+)、(++)、(+++)表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)中位數(shù)分別為2.14、1.81、1.54和0.32,在ER、PR、C-erbB-2(-)與ER、PR、C-erbB-2(++)、(+++)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。Notchl基因mRNA在ER、PR、C-erbB-2(-)、(+)、(++)、(+++)表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)中位數(shù)分別為0.14、0.81、1.64和2.52,在ER、PR、C-erbB-2(-)與ER、PR、C-erbB-2(++).(+++)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)；然而在ER、PR、C-erbB-2(-)與(+)組及(+)與(++)組、(++)與(+++)組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.免疫組化結(jié)果顯示：Notch1蛋白在乳腺正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率為33.82%,UDH陽(yáng)性表達(dá)率為39.39%。ADH中陽(yáng)性表達(dá)率為72.73%。DCIS中表達(dá)陽(yáng)性率為84.85%；IDC陽(yáng)性表達(dá)率為92.29%�？梢�(jiàn)Notch1蛋白表達(dá)水平在正常組織、UDH、ADH、DCIS及IDC中的逐漸增強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：ADH和UDH分別與DCIS比較Notch1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；正常乳腺組織和IDC組織中Notch1的表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.miR-203基因mRNA表達(dá)強(qiáng)度在正常乳腺組織、UDH、ADH、DCIS及IDC中分別為1.36、0.98、0.79、0.66和0.42。顯示在上述五種乳腺組織中其蛋白水平為逐漸減弱趨勢(shì)。兩兩比較乳腺正常組織與DCIS及IDC,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),同時(shí)DCIS與乳腺正常組織比較,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。Notch1基因mRNA表達(dá)強(qiáng)度在乳腺正常組織為0.36、UDH為0.68、ADH為0.79、DCIS為1.06及IDC中為1.56。顯示在上述五種乳腺組織中其蛋白水平為逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)。在兩兩比較乳腺正常組織與DCIS及IDC,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。4.乳腺癌中miR-203和Notch1蛋白表達(dá)的關(guān)系：Notch1蛋白表達(dá)低患者例(43),較高表達(dá)患者例(17)。分析表明miR-203和Notch1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及相應(yīng)癌旁組織中均呈負(fù)性相關(guān)。相關(guān)系數(shù)分別為-0.246(P0.05),-0.286(P0.05)。結(jié)論：(1)異常表達(dá)的miR-203和Notch1基因與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌有相關(guān),兩基因在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)生發(fā)展中的所起的作用也許不同。(2)miR-203和Notch1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和不同乳腺增生性組織中其蛋白表達(dá)強(qiáng)度存在差異。(3)miR-203和Notch1蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)為負(fù)性相關(guān)；在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中miR-203和Notch1基因異常表達(dá)在可能起著非常重要的調(diào)控作用。第三部分乳腺癌中miR-203和Notch1基因甲基化狀態(tài)與其發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系目的：：miR-203和Notch1基因甲基化在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能起重要作用。本研究旨在探討miR-203和Notch1基因甲基化在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)生中的作用。方法：采用MassArray方法對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC；n=96)、乳腺導(dǎo)管原位癌(DCIS;n=33)、乳腺非典型性導(dǎo)管增生癥(ADH；n=33)以及乳腺普通型導(dǎo)管增生癥(UDH；n=33)進(jìn)行miR-203、Notch1基因甲基化的定量檢測(cè)。運(yùn)用SP及RT-PCR法測(cè)定這4種乳腺組織中miR-203和Notch1蛋白的表達(dá)。結(jié)果：(1)miR-203基因基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG_1.2、CpG_3、CpG_8、CpG_9、CpG_10.11、CpG_14.15.16、CpG_19、CpG_23、CpG_24、CPG_25.26、CpG_27、CpG_28.29、CpG_30.31位點(diǎn)甲基化狀況從UDH、ADH、DCIS和IDC標(biāo)本中平均甲基化率呈逐漸下降趨勢(shì)；CpG_5.6、CpG_25.26位點(diǎn)的平均甲基化率在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管原位癌分別為22.6%和28.3%,甲基化水平高。miR-203基因啟動(dòng)子CpG_8、CpG_10.11位點(diǎn)在乳腺癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組平均甲基化率(分別為2.5%、3.1%),區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組的平均甲基化率(分別為9.1.%、8.6%),兩者之間的有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌miR-203基因啟動(dòng)子CpG_8.和CpG_19.20位點(diǎn)的甲基化水平在TNM分期間存在差異(p0.05)。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,結(jié)果為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌miR-203基因啟動(dòng)子CpG_8、CpG_16.17位點(diǎn)的平均甲基化率Ⅰ期(18.1%)Ⅱ期(9.5%)Ⅲ期(1.5%)。CpG_4.5位點(diǎn)的平均甲基化率Ⅰ期(25.3%)Ⅲ期(53%),CpG_20.21位點(diǎn)Ⅱ期(18.2%)Ⅲ期(29.5%)(p0.0083)。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)域中CpG_8位點(diǎn)的平均甲基化率Ⅰ級(jí)(18.5%)Ⅲ級(jí)(7.4%)、CpG_10.11位點(diǎn)Ⅰ級(jí)(16.3%)Ⅲ級(jí)(7.4%)；兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.0083)；CpG_4.5、CPG_20.21位點(diǎn)Ⅰ級(jí)(22.4%)Ⅲ級(jí)(36.4%)。CPG_25.26位點(diǎn)Ⅰ級(jí)(22.4%)Ⅲ級(jí)(36.4%)。在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌ER+PR+HER2—與ER—PR—C-erbB-2+之間中的比較,結(jié)果顯示乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)域中位點(diǎn)CpG_3、5、CpG_9、CpG_14.15、CpG22.23的平均甲基化率在ER+PR+ C-erbB-2—(25.6.3%)ER-PR-C-erbB-2+(6.3%),之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(2)Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG_3、CpG_4.5、CpG_8位點(diǎn)的平均甲基化率在IDC組低于DCIS.ADH和UDH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0083)。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG_4.5、CpG_8、CpG_10、CpG_15、CpG_18位點(diǎn)的平均甲基化率在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組(16.3%)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組(3.2%)(p0.0083)。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌Notch1基因啟動(dòng)子CpG_4.5、CpG_19位點(diǎn)的甲基化水平在臨床中不同TNM分期之間存在差異(p0.0083)。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌Notch1基因啟動(dòng)子CpG_4.5、CpG_19位點(diǎn)的平均甲基化率Ⅰ期(18.1%)Ⅱ期(9.5%)Ⅲ期(1.5%)。CpG_8位點(diǎn)的平均甲基化率Ⅰ期(25.3%)Ⅲ期(53%),CpG_12.13位點(diǎn)Ⅱ期(18.2%)Ⅲ期(29.5%),兩者之間的有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.0083)。Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)域中CpG_1.2、Cp G_12.13位點(diǎn)的平均甲基化率Ⅰ級(jí)(16.5%)Ⅲ級(jí)(8.4%)、CpG_10.11位點(diǎn)Ⅰ級(jí)(17.6%)Ⅲ級(jí)(6.5%)；兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.0083)。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌Notch1基因啟動(dòng)子CpG_3、CpG_8、CpG_14.15.16位點(diǎn)的平均甲基化率在ER+PR+C-erbB-2-(3.6%)ER-PR-C-erbB-2+(19.3％)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。(3)4種乳腺病變組織中miR-203和Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)域所有CpG位點(diǎn)的平均甲基化水平總量存在差異(P0.05)。在IDC組織中miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)域所有CpG位點(diǎn)的平均甲基化率為36.27%,Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)域所有CpG位點(diǎn)的平均甲基化率為14.86%,前者高于后者(P0.05)。將4組乳腺組織進(jìn)行兩兩比較,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后結(jié)果表明,miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG_4.5、CpG_10.11、CpG_21.22位點(diǎn)和Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG_3、CpG_4.5、CpG_9位點(diǎn)的平均甲基化率在IDC組小于其余3組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0083)。miR-203基因所有CpG位點(diǎn)平均甲基化水平與它蛋白表達(dá)強(qiáng)度之間出現(xiàn)正性相關(guān)(r=2.12),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Notch1基因所有CpG位點(diǎn)平均甲基化多少與它蛋白表達(dá)狀況之間呈負(fù)性相關(guān)(r=-0.82),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中存在miR-203和Notch1基因的廣泛低甲基化,同時(shí)miR-203蛋白表達(dá)顯著降低,Notch1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)。他們呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān),提示miR-203和Notch1基因廣泛低甲基化可能導(dǎo)致其蛋白表達(dá)發(fā)生變化,這在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著非常的重要的作用。miR-203基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG_4.5、CpG_10.11、CpG_21.22位點(diǎn)和Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG_3、CpG_4.5、CpG_9位點(diǎn)的平均甲基化水平降低與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)生發(fā)展具有顯著相關(guān),表明相關(guān)基因特定的CpG位點(diǎn)的甲基化水平降低也許在乳腺組織從良性輕度增生向惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生演進(jìn)中起著重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

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1 張燕;鄭志z，

本文編號(hào)：1909361