本文選題：B細胞非霍奇金淋巴瘤 + 彌漫大B細胞淋巴瘤��； 參考：《安徽醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：非霍奇金淋巴瘤(NHL)按細胞來源分為B細胞淋巴瘤和T細胞/NK細胞淋巴瘤。B細胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)是一種定向于B細胞系的淋巴細胞腫瘤,在全世界,85%以上的NHL是成熟B-NHL。 B-NHL分為若干個亞型,包括彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)和伯基特淋巴瘤(BL). DLBCL是最常見的B-NHL,占成人NHL的30%-40%,在兒童NHL中的比例不足5%。BL好發(fā)于兒童和青少年,占所有NHL的3%-5%,占兒童NHL的40%。DLBCL和BL都屬于侵襲性B-NHL,在免疫缺陷患者中發(fā)病率均顯著增高。聯(lián)合化療,是DLBCL和BL患者目前最有效的治療方案。但是,仍有部分患者難以耐受很多免疫化學療法的毒性,或因腫瘤進展而死亡,因此尋找更加新穎的治療方法,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點仍然是目前工作的重點。免疫球蛋白D(IgD)分為分泌型IgD和膜結(jié)合型IgD,在抗原識別、B淋巴細胞分化和激活以及免疫反應調(diào)節(jié)上發(fā)揮重要作用。IgD還與B淋巴細胞的外周清除有關(guān),干擾免疫耐受的誘導。IgD受體(IgDR)與IgD結(jié)合可以介導B細胞自身反應、T和B細胞活化及相互作用。IgD及IgDR有可能成為B細胞惡性增殖相關(guān)疾病的新的治療靶點,阻斷IgD-IgDR之間的相互作用可能成為B-NHL免疫療法新目標。本課題先從臨床入手,選取初診DLBCL患者淋巴結(jié)病理組織標本及外周血樣本,運用免疫組化(IHC)、流式細胞術(shù)(FCM)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等方法檢測IgD及IgDR在DLBCL患者體內(nèi)的表達。并結(jié)合體外實驗觀察外源性人IgD (hIgD)蛋白對Daudi、MEC-2和REC-1三種B-NHL細胞的促增殖作用,以Daudi細胞為研究對象,研究hIgD對其促增殖作用的部分機制,探討IgD及IgDR在B-NHL發(fā)病中所起的作用以及為其成為新靶點的可能性提供實驗依據(jù)。目的：選取DLBCL患者淋巴結(jié)病理組織標本及外周血樣本,觀察IgD及IgDR的表達,并分析其與DLBCL臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)合體外實驗觀察hIgD對Daudi、MEC-2和REC-1三種B-NHL細胞的促增殖作用,選擇Daudi細胞為研究對象,研究hIgD對其促增殖作用的部分機制,探討IgD及IgDR在淋巴瘤發(fā)病中所起的作用以及為其成為新靶點的可能性提供實驗依據(jù)。方法：為了觀察IgD及IgDR在DLBCL患者體內(nèi)的表達情況,我們臨床收集了34例DLBCL患者和14例反應性增生淋巴結(jié)病理組織標本,16例初診DLBCL患者和10例健康志愿者的外周血樣本,完善相關(guān)臨床資料。采用IHC觀察IgD和IgDR在淋巴結(jié)病理組織標本中的表達情況；ELISA法檢測血清中IgD水平；分離外周血單個核細胞(PBMCs), FCM檢測IgD和IgDR的表達情況；采用卡方檢驗(Fisher精確概率法)和Spearman相關(guān)性分析法分析IgD和IgDR與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。為了觀察hIgD蛋白對Daudi、MEC-2和REC-1三種B-NHL細胞的促增殖作用,以及hIgD對Daudi細胞促增殖作用的部分機制,我們體外培養(yǎng)Daudi、MEC-2和REC-1細胞,采用CCK-8法檢測細胞活力；FCM檢測Daudi細胞CD19、IgM、 IgD和IgDR的表達情況、Daudi細胞周期及細胞凋亡率；實時熒光定量PCR (QRT-PCR)法檢測Daudi細胞c-myc、cyclin D3、CDK6和p16~(INK4a) mRNA的表達；Western blot法檢測Daudi細胞c-myc、cyclinD3、CDK6、p16~(INK4a)、70kD蛋白酪氨酸磷酸化、Lyn和p-Lyn蛋白的表達。結(jié)果：1.IgD和IgDR在DLBCL患者體內(nèi)表達且與臨床病理參數(shù)具有相關(guān)性IHC結(jié)果表明：IgD和IgDR在DLBCL患者淋巴結(jié)病理組織上表達且定位于腫瘤細胞的細胞膜/漿上。在34例DLBCL患者淋巴結(jié)病理組織中IgD的陽性表達率為47.1%(16/34),IgDR的陽性表達率為55.9%(19/34)。與反應性增生的淋巴結(jié)病理組織相比,DLBCL患者淋巴結(jié)組織中IgD和IgDR表達均上調(diào)(P0.05),且IgD與IgDR表達顯著相關(guān)(r=0.426,P=0.02)。進一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),IgD的陽性表達與血清β2-微球蛋白(β2-MG)水平相關(guān)(r=0.408, P=0.035)o IgDR的陽性表達與血清的LDH水平(r=0.46,P=0.013)及國際淋巴瘤預后指標(IPI)評分(r=0.407,P=0.025)相關(guān)。ELISA結(jié)果顯示：與健康志愿者相比,初發(fā)DLBCL患者外周血血清中IgD (26.15±1.7 μg/ml)水平明顯升高(P=0.014),并且與血清β2-MG (r=0.574, P=0.02)、LDH水平呈正相關(guān)(r=0.558,P=0.024)。流式結(jié)果發(fā)現(xiàn)DLBCL患者外周血PBMCs的IgD平均熒光強度(MFI)(16.49±2.08 vs.10.44±1.89)和IgDR (13.33±1.83 vs.6.74±1.01) MFI都明顯高于健康對照組的水平。以上研究結(jié)果提示：DLBCL患者淋巴結(jié)病理組織和外周血PBMCs中IgD和IgDR及血清中IgD表達均上調(diào),并且與不良預后因素相關(guān),從臨床角度初步發(fā)現(xiàn)了IgD與IgDR介導的信號通路可能在DLBCL患者體內(nèi)處于異常激活的狀態(tài),并且可能參與了DLBCL的病變過程。2. hIgD促進Daudi、MEC-2和REC-1細胞增殖,加速Daudi細胞G1/S轉(zhuǎn)換,加快Daudi細胞周期進程體外培養(yǎng)并選取對數(shù)生長期的Daudi細胞,用不同濃度的hIgD (0.1,0.3,1, 3, 10μg/ml)刺激不同時間(12,24,48,72 h),同時選取對數(shù)生長期的MEC-2和REC-1細胞,用hIgD (3 μg/ml)刺激48 h,觀察細胞活力和增殖情況。結(jié)果表明：與對照組相比,hIgD明顯促進Daudi、MEC-2和REC-1細胞的活力和增殖；Annexin-V/PI流式檢測結(jié)果顯示hIgD (3μg/ml)降低了Daudi細胞的凋亡率;PI流式檢測結(jié)果顯示hIgD作用于Daudi細胞增殖周期的G1期和S期發(fā)揮促增殖作用。與對照組相比,hIgD刺激后Daudi GI期細胞比例逐漸降低,S期細胞比例逐漸升高,而G2期細胞比例變化不明顯。提示hIgD通過加速GI/S時相轉(zhuǎn)換促進Daudi細胞周期進程。進一步檢測Daudi細胞c-myc、cyclin D3、CDK6和p16~(INK4a)因子的mRNA和蛋白表達,Q-PCR和Western結(jié)果顯示：與對照組相比,hIgD刺激后Daudi細胞c-myc、cyclin D3、CDK6的mRNA和蛋白表達明顯升高,而pl6INK4a表達明顯降低。以上結(jié)果提示：hIgD加速GI/S時相轉(zhuǎn)換,加快細胞周期進程促進Daudi細胞增殖可能與其調(diào)控c-myc與cyclin D3-CDKe-p16~(INK4a)表達有關(guān)。3. hIgD誘導IgDR的表達,啟動酪氮酸磷酸化途徑可能是促進Daudi細胞增殖的重要機制FCM檢測顯示Daudi細胞表面CD19+、IgD-、IgM+、IgDR+,提示Daudi細胞是未成熟的B細胞。hIgD(1,3, 10μg/ml)刺激24 h后,與對照組相比,hIgD明顯上調(diào)Daudi細胞表面IgDR的表達。收集對數(shù)生長期Daudi細胞用hIgD(1,3, 10 μg/ml)刺激24h以后提取蛋白用Western blot法檢測。結(jié)果顯示：與對照組相比,hIgD刺激后Daudi細胞70kD蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化,我們推測這個蛋白是IgDR的組成成分,接著進一步檢測了下游信號Lyn,發(fā)現(xiàn)p-Lyn蛋白表達明顯升高,而Lyn蛋白表達沒有明顯變化。由此我們推測：hIgD與IgDR結(jié)合以后促進Daudi細胞增殖可能與激活酪氨酸磷酸化途徑有關(guān)。結(jié)論：1.DLBCL患者淋巴結(jié)病理組織中IgD和IgDR表達明顯上調(diào),且IgD與IgDR表達顯著相關(guān),并且與血清β_2-MG、LDH、IPI評分指標相關(guān)。初診DLBCL患者外周血血清中IgD水平明顯升高,并且與血清β2-MG、LDH水平呈正相關(guān)。初診DLBCL患者外周血PBMCs中IgD和IgDR表達上調(diào)。提示：IgD與IgDR在DLBCL患者體內(nèi)處于異常激活的狀態(tài),可能參與了DLBCL的病變過程。2. hIgD促進Daudi、MEC-2和REC-1細胞的活力和增殖,減少Daudi細胞凋亡,降低Daudi G1期細胞比例,升高S期細胞比例,升高Daudi細胞c-myc、cyclin D3、CDK6的mRNA和蛋白表達,降低p16~(INK4a)表達。提示：hIgD加速G1/S時相轉(zhuǎn)換,加快細胞周期進程促進Daudi細胞增殖可能與其調(diào)控c-myc與cyclin D3-CDK6-p16~(INK4a)表達有關(guān)。3. hIgD明顯上調(diào)Daudi細胞表面IgDR的表達,促進Daudi細胞70kD蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化,下游信號p-Lyn蛋白表達明顯升高,而Lyn蛋白表達沒有明顯變化。提示：hIgD與IgDR結(jié)合以后促進Daudi細胞增殖可能與激活酪氨酸磷酸化途徑有關(guān)。
[Abstract]:Non - Hodgkin ' s lymphoma ( NHL ) is divided into B - cell lymphoma and T - cell / NK - cell lymphoma by cell source . B - cell non - Hodgkin ' s lymphoma ( B - NHL ) is a lymphocyte tumor oriented to B - cell line . In the world , more than 85 % of NHL is mature B - NHL . B - NHL is divided into several subtypes , including diffuse large B - cell lymphoma and primary primary lymphoma ( BL ) . The study of IgD and IgD plays an important role in the pathogenesis of B - NHL .
The level of IgD in serum was determined by ELISA .
Peripheral blood mononuclear cells ( PBMCs ) were isolated and the expression of IgD and IgDR was detected by FCM .
In order to observe the effect of hIgD protein on Daudi , MEC - 2 and REC - 1 cells , we cultured Daudi , MEC - 2 and REC - 1 cells in vitro .
FCM was used to detect the expression of CD19 , IgM , IgD and IgDR in Daudi cells , Daudi cell cycle and cell apoptosis rate .
Real - time fluorescence quantitative PCR ( QRT - PCR ) method was used to detect the expression of c - myc , cyclin D3 , CD6and p16 ~ ( INK4a ) mRNA in Daudi cells .
The positive expression of IgD and IgDR was significantly correlated with serum levels of 尾 2 - MG ( r = 0.408 , P = 0 . 025 ) . The results showed that the positive expression of IgD and IgDR was 47.1 % ( 16 / 34 ) , and the positive expression of IgD was 55.9 % ( P = 0 . 025 ) . The levels of IgD and IgDR and IgD in peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) were significantly higher than those in healthy controls .
The results showed that hIgD could promote Daudi cell cycle progression by accelerating GI / S phase transformation . The results suggested that hIgD could promote Daudi cell cycle progression by accelerating GI / S phase transformation . The results showed that the expression of IgD and IgDR in peripheral blood mononuclear cells ( LIgD ) was significantly higher than that of control group . hIgD up - regulate the expression of IgDR on Daudi cell , promote the tyrosine phosphorylation of the 70kD protein of Daudi cell , the expression of downstream signal p - Lyn protein is obviously increased , and the expression of Lyn protein has no obvious change .
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.1

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本文編號：1901958