本文選題：肝細(xì)胞肝癌 + HC6R1�。� 參考：《蘇州大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:1.鑒定HC6R1的特異性及其識(shí)別位點(diǎn);2.研究HC6R1對(duì)肝細(xì)胞肝癌的抗瘤作用及其機(jī)制。方法:用人肝癌組織免疫小鼠,通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備抗體。采用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化檢測(cè)HC6R1是否能夠特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞和組織。通過(guò)免疫共沉淀及質(zhì)譜分析鑒定HC6R1的識(shí)別位點(diǎn)。構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞使得IL6R基因沉默,以HC6R1和anti-IL6R作為一抗,通過(guò)Western blotting和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證明其識(shí)別位點(diǎn)。利用一系列的體外實(shí)驗(yàn)如CCK8、劃痕實(shí)驗(yàn)、粘附實(shí)驗(yàn)和Transwell分別檢測(cè)HC6R1對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、粘附和侵襲能力的影響;通過(guò)皮下注射HepG2和Huh7細(xì)胞建立腫瘤模型研究HC6R1對(duì)體內(nèi)腫瘤的抑制作用。采用Annexin V/PI雙染和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HC6R1對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)HC6R1作用的靶基因。以STAT3、p-STAT3、CyclinD1和CDK4抗體作為一抗,用Western blotting檢測(cè)其靶向基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果:1.HC6R1的制備和鑒定1.1利用雜交瘤技術(shù)制備并篩選出一種陽(yáng)性單克隆抗體即HC6R1。1.2對(duì)人肝癌細(xì)胞系/肝癌組織和其他細(xì)胞/組織進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn):HC6R1可以被人肝癌細(xì)胞和肝癌組織識(shí)別,而在正常肝臟細(xì)胞和癌旁組織中幾乎檢測(cè)不到HC6R1。1.3通過(guò)免疫共沉淀及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)HC6R1抗體識(shí)別的抗原可能是IL6R。采用Western blotting和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞內(nèi)IL6R基因敲低后,HC6R1抗原和anti-IL6R的表達(dá)量均明顯減少,進(jìn)一步證實(shí)其識(shí)別的抗原為肝癌細(xì)胞的IL6R。2.HC6R1對(duì)肝癌的抗瘤作用及其機(jī)制研究2.1 CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HC6R1處理組細(xì)胞的增殖速度明顯慢于mIgG處理的對(duì)照組;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HC6R1能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移,粘附實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HC6R1能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的粘附和侵襲能力。2.2.利用肝癌細(xì)胞對(duì)小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HC6R1可以抑制小鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng);同時(shí)可以抑制原位成瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)并有效延長(zhǎng)原位成瘤小鼠的生存時(shí)間。2.3通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),HC6R1可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞細(xì)胞的凋亡,并且能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯在G1/S期,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)HC6R1作用的靶基因發(fā)現(xiàn)Bcl-2,Bcl-x L,Survivin,Myc,Cyclin D1,VEFG,HIF-1,MMP-2,IL-6和IL-10基因顯著活化,其中大部分基因是STAT3信號(hào)通路的下游基因。通過(guò)Western blotting檢測(cè)其靶向基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)HC6R1抗體可以下調(diào)HepG2和Huh7細(xì)胞p-STAT3、CyclinD1和CDK4的基因表達(dá)水平。結(jié)論:1.HC6R1能夠特異性識(shí)別人肝癌細(xì)胞和組織,其作用位點(diǎn)為IL6R。2.HC6R1能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、粘附及侵襲。3.HC6R1可以顯著抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。4.HC6R1可以阻斷IL6介導(dǎo)的JAK/STAT3信號(hào)通路,通過(guò)抑制其下游STAT3蛋白的磷酸化阻滯G1期細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和CDK4的表達(dá)從而將細(xì)胞周期抑制在G1/S期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Purpose 1. To identify the specificity and recognition site of HC6R1. To study the anti-tumor effect of HC6R1 on hepatocellular carcinoma and its mechanism. Methods: mice were immunized with human liver cancer and antibody was prepared by hybridoma technique. Flow cytometry and immunohistochemistry were used to detect whether HC6R1 could specifically recognize hepatoma cells and tissues. The identification sites of HC6R1 were identified by immunoprecipitation and mass spectrometry. The IL6R gene was silenced by the construction of vector transfection cells, HC6R1 and anti-IL6R were used as the first antibody, and the recognition sites were further proved by Western blotting and flow cytometry. A series of in vitro experiments, such as CCK8, scratch test, adhesion test and Transwell, were used to detect the effects of HC6R1 on the proliferation, migration, adhesion and invasion of HCC cells. Tumor models were established by subcutaneous injection of HepG2 and Huh7 cells to study the inhibitory effect of HC6R1 on tumor in vivo. Annexin V/PI double staining and flow cytometry were used to detect the effect of HC6R1 on apoptosis and cell cycle of hepatoma cells. The target genes acting on HC6R1 were detected by gene chip technique. The anti-cyclin D1 and CDK4 antibodies were used to detect the protein expression level of the target gene by Western blotting. Results 1. The preparation and identification of HC6R1. 1. Using hybridoma technique to prepare and screen a positive monoclonal antibody, HC6R1.1.2 was used to detect human hepatoma cell line / liver cancer tissue and other cells / tissues by flow cytometry and immunohistochemistry. HC6R1 can be recognized by human hepatoma cells and liver cancer tissues. However, HC6R1.1.3 could hardly be detected in normal liver cells and paracancerous tissues. It was found by immunoprecipitation and mass spectrometry that the antigen recognized by HC6R1 antibody was probably IL6R. Western blotting and flow cytometry analysis showed that the expression of HC6R1 antigen and anti-IL6R in HCC cells after knockout was significantly decreased. Further confirmed the antitumor effect of IL6R.2.HC6R1 on HCC and its mechanism 2.1 CCK8 detection showed that the proliferation rate of HC6R1 treated group was significantly slower than that of mIgG treated control group. The results of scratch test showed that HC6R1 could significantly inhibit the migration of hepatoma cells. The adhesion test and Transwell assay showed that HC6R1 could significantly inhibit the adhesion and invasion of hepatoma cells. It was found that HC6R1 could inhibit the growth of subcutaneous tumor in mice by tumorigenesis of hepatoma cells in vivo. At the same time, HC6R1 could inhibit the growth of tumor and prolong the survival time of in situ tumor-bearing mice. 2.3 by detecting apoptosis and cell cycle, HC6R1 could promote apoptosis of hepatoma cells. And can block cell cycle at G 1 / S phase, thus inhibiting the proliferation of tumor cells. Gene chip technique was used to detect the target genes acting on HC6R1. It was found that Bcl-2CX Bcl-x LHcl-x survivin D1VEFGG, HIF-1MMP 2, IL-6 and IL-10 genes were significantly activated, most of which were downstream genes of STAT3 signaling pathway. Western blotting analysis showed that HC6R1 antibody could down-regulate the expression of p-STAT3CyclinD1 and CDK4 in HepG2 and Huh7 cells. Conclusion: 1. HC6R1 can specifically recognize human hepatoma cells and tissues, and its action site is that IL6R.2.HC6R1 can significantly inhibit the proliferation and migration of HCC cells. Adhesion and invasion. 3. HC6R1 could significantly inhibit the growth of mouse tumor and prolong the survival time of mice. 4. HC6R1 could block the JAK/STAT3 signaling pathway mediated by IL6. The phosphorylation of downstream STAT3 protein inhibited the expression of cyclin CyclinD1 and CDK4 in G1 phase, thereby inhibiting cell cycle at G 1 / S phase and promoting cell apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1897078