本文選題：PDPN + 單克隆抗體　； 參考：《蘇州大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景:由于環(huán)境,飲食,生活習(xí)慣與工作壓力,以及遺傳等因素,腫瘤的發(fā)生率與死亡率一直居高不下,其中一個導(dǎo)致死亡的重要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移。但迄今對于腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍然不太清楚。近幾年來,越來越多的證據(jù)顯示血小板在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。血小板在腫瘤轉(zhuǎn)移中的機(jī)制可能有以下幾種:1.人們發(fā)現(xiàn)很多腫瘤細(xì)胞直接誘導(dǎo)血小板活化(釋之為:Tumor cell-induced platelet aggregation TIPA)�；罨难“遽尫藕芏嗉�(xì)胞因子,包括血小板衍生血管生長因子等。這些細(xì)胞因子能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長,有助于血管的再生;2.腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致血小板活化,活化的血小板通過釋放ADP合成血栓烷A2(TXA2)等,最后導(dǎo)致整合素糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的活化。腫瘤患者活化性的血小板升高,更加促進(jìn)了上述過程的發(fā)生發(fā)展;3.活化的血小板直接粘附在腫瘤細(xì)胞表面,從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫攻擊,同時也有助于腫瘤細(xì)胞的著床、粘附,從而有利于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在血小板與腫瘤細(xì)胞的相互作用中,PDPN是關(guān)鍵因素之一。PDPN是Ι型唾液粘蛋白,是淋巴管內(nèi)皮的特異性標(biāo)志物。PDPN胞外區(qū)中的EDxxVTPG片段是刺激血小板聚集的結(jié)構(gòu)域(platelet aggregation-stimulating,PLAG),其中Thr52是O-聚糖唾液酸化的位點,血小板表面表達(dá)的CLEC-2是PDPN的內(nèi)源性受體,與PDPN結(jié)合依賴于O-聚糖唾液酸的存在中心,不依賴血漿成分,結(jié)合后可以直接誘導(dǎo)血小板的活化聚集。最近發(fā)現(xiàn)很多腫瘤細(xì)胞(肺腫瘤、胃腫瘤、腸腫瘤、鱗狀上皮細(xì)胞癌、惡性間皮瘤、Kaposi肉瘤、血管肉瘤、睪丸精原細(xì)胞瘤和腦腫瘤等)表達(dá)PDPN上調(diào),PDPN上調(diào)能引起血小板活化,這可能是血小板促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移與生長的基礎(chǔ)。抗PDPN的PLAG區(qū)功能性單克隆抗體通過抑制PDPN與CLEC-2的結(jié)合,阻止血小板的活化聚集,從而能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移,而且不會出現(xiàn)抗血小板聚集藥物引起的出血風(fēng)險,有很大的臨床應(yīng)用價值。抗人PDPN抗原不同表位的單克隆抗體可以建立起雙抗體夾心elisa法,用于檢測癌癥等患者的血漿中可溶性pdpn(spdpn)的水平。血漿中spdpn的水平在腫瘤的診斷與預(yù)后中的作用有待確定。目的:本研究旨在應(yīng)用單克隆抗體技術(shù),制備能夠識別pdpn蛋白的單克隆抗體,用以探討pdpn與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系;建立雙抗體夾心方法,檢測癌癥患者血漿中spdpn的含量,研究spdpn在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:(1)首先免疫balb/c小鼠,22肽的多肽片段(dtettgleggvampgaeddvvc)與鑰孔戚血藍(lán)素(klh)偶聯(lián)作為免疫原。dtettgleggvampgaeddvv是位于pdpn蛋白結(jié)構(gòu)功能區(qū)域的第31-51位氨基酸。(2)經(jīng)過傳統(tǒng)單克隆抗體制備技術(shù),制備出抗pdpn的單克隆抗體;然后以商品化抗pdpn單抗18h5為陽性對照,以正常小鼠igg為陰性對照,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)、蛋白印跡(westernblot)和流式細(xì)胞(flowcytometry)方法驗證單克隆抗體與pdpn的特異性結(jié)合能力。(3)抗pdpn抗體體外功能的研究:pdpn能夠與血小板表面表達(dá)的clec-2結(jié)合,并且活化血小板,誘導(dǎo)血小板聚集。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)pdpn上調(diào),將抗pdpn抗體與腫瘤細(xì)胞提前混合反應(yīng),然后再與血小板(prp)混合,用血小板聚集儀檢測血小板聚集情況。從而分析抗pdpn抗體能否抑制pdpn誘導(dǎo)的血小板聚集。(4)抗pdpn單克隆抗體在檢測人血漿中spdpn含量的應(yīng)用:兩種單克隆抗體sz-168和sz-163可以與pdpn的不同抗原表位結(jié)合,以此建立雙抗體夾心elisa方法,用該法檢測癌癥等患者的血漿spdpn水平,從而分析血漿spdpn水平在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及診斷中的作用。結(jié)果:用偶聯(lián)了klh的22個氨基酸組成的pdpn多肽免疫balb/c小鼠,經(jīng)過三次免疫程序,最后小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合制備單克隆抗體。經(jīng)間接elisa法成功篩選出兩株單克隆抗體sz163和sz168,經(jīng)腹水?dāng)U大生產(chǎn)后,純化,測得效價分別為500ng/ml和15ng/ml,然后用elisa、westernblot和flowcytometry(fcm)方法驗證單克隆抗體與還原性pdpn以及天然的細(xì)胞表面表達(dá)的pdpn結(jié)合的特異性。結(jié)果顯示該抗體具有免疫結(jié)合的特異性。另外,我們通過FCM方法,應(yīng)用單抗SZ168檢測到NCI-H226細(xì)胞表面高水平表達(dá)PDPN蛋白。通過血小板聚集儀,利用NCI-H226細(xì)胞檢測到單抗SZ168能夠抑制PDPN誘導(dǎo)的血小板聚集(10μg/ml:抑制率-74.6%、6μg/ml:抑制率-66.1%、3μg/ml:抑制率-8.47%)。最后,我們建立了雙抗體夾心ELISA方法(SZ163包板,辣根過氧化物酶標(biāo)記的SZ168作為酶標(biāo)單抗),檢測了腫瘤患者(胃癌、肺癌、腸癌)與正常志愿者血漿中的sPDPN的含量,統(tǒng)計分析顯示,腫瘤患者血漿中sPDPN含量高于正常志愿者血漿中的含量(P0.01),腫瘤患者中發(fā)生轉(zhuǎn)移的血漿中sPDPN含量高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的血漿中sPDPN含量(P0.01)。結(jié)論:(1)利用雜交瘤技術(shù)成功制備了兩株效價高、特異性好的抗PDPN單克隆抗體SZ163與SZ168。這兩株抗體具有抗原識別特異性,能用ELISA、FCM和Western Blot鑒定,并且可以應(yīng)用FCM來檢測細(xì)胞株上PDPN的表達(dá)量。(2)體外實驗證明,高表達(dá)PDPN的腫瘤細(xì)胞能夠誘導(dǎo)血小板聚集,抗PDPN的單克隆抗體SZ168與腫瘤細(xì)胞混合后再與血小板反應(yīng),能夠抑制血小板的聚集。這為進(jìn)一步研究PDPN在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用提供支持依據(jù)。(3)雙抗體夾心ELISA法檢測正常志愿者與腫瘤患者血漿中sPDPN的含量,結(jié)果說明sPDPN能夠作為腫瘤標(biāo)志物,且能夠提示腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移情況。
[Abstract]:Background : Because of environment , diet , living habits and working pressure , and inheritance , the incidence and mortality of tumors have remained high , one of the important reasons leading to death is metastasis of tumors . 媧誨寲鐨勮灝忔澘閲婃斁寰堝緇嗚優(yōu)鍥犲瓙,鍖呮嫭琛，

本文編號：1889877