本文選題：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb) + 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)��； 參考：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:研究腫瘤抑制蛋白Rb抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2 (the mechanistic target of rapamycin complex 2,mTORC2 )的機(jī)制及方式 。方法:通過免疫印跡法(WesternBlot)檢測Rb基因的敲除小鼠胚胎纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs),多種腫瘤細(xì)胞的Rb shRNA穩(wěn)定株和腫瘤細(xì)胞tet-on Rb過表達(dá)穩(wěn)定株的mTOR通路蛋白水平及其磷酸化水平,證實(shí)Rb抑制mTORC2活性。通過免疫共沉淀(co-immunoprecipitate,Co-IP), GST 沉降(GSTpull down),凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)等方法證實(shí)Sin1為Rb的作用蛋白。將全長Sin1載體通過分子克隆片段化為N、CRIM、RBD和PH四個(gè)結(jié)構(gòu)域,證實(shí)PH結(jié)構(gòu)域?yàn)镽b作用的靶點(diǎn)。結(jié)果:與Rbloxp/loxpMEFs相比,Rb-/-MEFs顯示出增加的Akt Ser 473的磷酸化水平,提示其mTORC2功能增加,而反映mTORC1功能的S6K Thr389磷酸化水平未見明顯變化,提示Rb特異性抑制mTORC2功能。腫瘤細(xì)胞宮頸癌細(xì)胞系HeLa,卵巢癌細(xì)胞系OVCAR5和乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 Rb shRNA穩(wěn)定細(xì)胞株中進(jìn)一步確認(rèn)Rb特異性抑制mTORC2活性,而不影響mTORC1活性。在pTRIPZ-HA-Rb OVCAR5細(xì)胞株中,加入強(qiáng)力霉素(doxycycline)誘導(dǎo)Rb的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Rb表達(dá)水平的增加伴有Akt Ser473的磷酸化水平的下降。過表達(dá)Rb進(jìn)行Co-IP以及全內(nèi)源Co-IP提示Sin1為mTORC2復(fù)合物中唯一與Rb結(jié)合的蛋白,且Sin1-PH結(jié)構(gòu)域?yàn)镽b作用的靶點(diǎn)。結(jié)論:Rb通過結(jié)合Sin1-PH結(jié)構(gòu)域特異性抑制mTORC2活性,而不影響mTORC1活性。
[Abstract]:Aim: to study the mechanism and mechanism of tumor suppressor protein RB in inhibiting mammalian rapamycin target protein complex 2 and the mechanistic target of rapamycin complex 2 mTORC2. Methods: Western blot was used to detect the level of mTOR pathway protein and phosphorylation of RB gene knockout mouse embryonic fibroblast MEF, RB shRNA stable cell and tet-on RB overexpression stable strain. It was confirmed that RB inhibited mTORC2 activity. The co-immunoprecipitate co-IPP, GST sedimentation and GST pull downdown, gel filtration chromatography gel filtration chromatography-were used to confirm that Sin1 is a RB acting protein. The full-length Sin1 vector was transformed into four domains by molecular cloning. It was confirmed that the PH domain was the target of RB action. Results: compared with Rbloxp/loxpMEFs, Rb-P / -MEFs showed an increased phosphorylation level of Akt Ser 473, indicating an increase in mTORC2 function, but no significant change in S6K Thr389 phosphorylation level reflecting mTORC1 function, suggesting that RB specifically inhibited mTORC2 function. In tumor cell line HeLa, ovarian cancer cell line OVCAR5 and breast cancer cell line MDA-MB-231 RB shRNA stable cell line, it was further confirmed that RB specifically inhibited mTORC2 activity, but did not affect mTORC1 activity. The expression of RB was induced by adding doxycycline (doxycycline) to pTRIPZ-HA-Rb OVCAR5 cell line. It was found that the increase of RB expression was accompanied by the decrease of phosphorylation of Akt Ser473. Overexpression of RB for Co-IP and total endogenous Co-IP suggest that Sin1 is the only protein binding to RB in mTORC2 complexes and Sin1-PH domain is the target of RB binding. ConclusionThe specific inhibition of mTORC2 activity by binding to Sin1-PH domain does not affect the activity of mTORC1.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.91

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本文編號：1880719