發(fā)布時(shí)間：2018-05-08 03:42

  本文選題：多發(fā)性骨髓瘤 + miR-145　； 參考：《吉林大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的： 探討miRNA-145在體內(nèi)外對(duì)多發(fā)性骨髓瘤（MM）的增殖、凋亡、侵襲、遷移功能的影響，并研究其可能的作用機(jī)制，為多發(fā)性骨髓瘤的早期診斷和臨床治療提供新的可能靶點(diǎn)和理論依據(jù)。 方法： RT-qPCR檢測(cè)MM細(xì)胞株H929、MM1S及RPMI-8226中miR-145的表達(dá)，得到初步結(jié)果后，檢測(cè)MM患者及正常志愿者血漿miR-145的表達(dá)；RT-qPCR法對(duì)miR-145模擬物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至MM細(xì)胞H929的轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行驗(yàn)證；MTT法和BrdU摻入法檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-145組細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞克隆形成能力；流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-145的H929細(xì)胞周期分布及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1和p21蛋白的表達(dá)；TUNEL法、ELISA法和Western blot法檢測(cè)miR-145轉(zhuǎn)染48h后H929細(xì)胞內(nèi)Caspase活性，以及重要抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá)；Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-145對(duì)H929細(xì)胞侵襲及遷移的影響；ELISA法檢測(cè)miR-145對(duì)細(xì)胞上清液VEGF的分泌；Western blot法檢測(cè)miR-145對(duì)金屬蛋白酶家族成員MMP-2及MMP-9表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明miR-145影響細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制；Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-145組細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路以及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)活性，，進(jìn)一步探討miR-145影響MM細(xì)胞增殖、凋亡的作用機(jī)制；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)小鼠皮下腫瘤的體積和重量，RT-qPCR法檢測(cè)miR-145的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)小鼠腫瘤VEGF濃度，TUNEL法分析小鼠體內(nèi)MM細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果： MM細(xì)胞株H929, MM1S及RPMI-8226中miR-145的表達(dá)水平均低于正常志愿者對(duì)照組，臨床收集的25例MM患者血漿中miR-145的表達(dá)水平顯著低于正常志愿者對(duì)照組，即miR-145在MM細(xì)胞系及MM患者的血漿中普遍低表達(dá)；RT-qPCR法對(duì)轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行驗(yàn)證；MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，與陰性對(duì)照組比較，miR-145過(guò)表達(dá)組OD570顯著下降，并且在轉(zhuǎn)染后第2天其活力便顯著低于陰性對(duì)照組，第4天和第5天差異更加顯著（p＜0.01）；BrdU摻入法和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與MTT法一致，即miR-145過(guò)表達(dá)組MM細(xì)胞細(xì)胞克隆形成能力顯著降低；流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞進(jìn)行周期分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-145過(guò)表達(dá)組細(xì)胞分布在G1期的細(xì)胞群體顯著增多，而S期細(xì)胞百分比大大下降，G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化，說(shuō)明miR-145主要使細(xì)胞周期阻滯在G1期進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖；進(jìn)一步研究細(xì)胞周期阻滯的作用機(jī)制，以Western blot法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1和p21的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-145組細(xì)胞內(nèi)cyclin D1水平顯著降低，p21蛋白表達(dá)水平顯著上升；TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-145過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡顯著增加；ELISA法發(fā)現(xiàn)，miR-145過(guò)表達(dá)組Caspase的活性顯著升高，與此同時(shí)，Western blot法檢測(cè)到miR-145過(guò)表達(dá)的H929細(xì)胞組Bcl-2蛋白和Survivin蛋白的表達(dá)水平顯著下降，說(shuō)明miR-145對(duì)細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制可能與Bcl-2蛋白和Survivin蛋白的表達(dá)下調(diào)相關(guān)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-145過(guò)表達(dá)組中穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)與遷移出小室的細(xì)胞數(shù)相比于陰性對(duì)照組都顯著降低；ELISA法發(fā)現(xiàn)miR-145過(guò)表達(dá)組能顯著抑制H929細(xì)胞中VEGF的分泌；Western blot法發(fā)現(xiàn)miR-145過(guò)表達(dá)組中MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降低；Western blot法發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-145組磷酸化PI3K和AKT蛋白表達(dá)下降，PI3K和AKT總蛋白含量不變；小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，miR-145過(guò)表達(dá)組腫瘤體積減小，重量減輕，VEGF濃度顯著降低、凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增加。 結(jié)論： miR-145是多發(fā)性骨髓瘤的抑癌基因，miR-145主要通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性抑制MM細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，并利用MM小鼠進(jìn)一步證實(shí)了miR-145對(duì)MM腫瘤增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)作用；上調(diào)miR-145表達(dá)可抑制MM細(xì)胞遷移和侵襲，機(jī)制與抑制VEGF的分泌及MMP-2、MMP-9表達(dá)相關(guān)；因此，miR-145很可能成為MM治療過(guò)程中的一個(gè)重要的潛在靶點(diǎn)，深入研究miR-145與MM的關(guān)系具有重要的理論和臨床價(jià)值。
[Abstract]:Purpose :

To investigate the effect of miRNA - 145 on the proliferation , apoptosis , invasion and migration of multiple myeloma ( MM ) in vitro and to study the possible mechanism of miRNA - 145 , which provides a new possible target and theoretical basis for early diagnosis and clinical treatment of multiple myeloma .

Method :

The expression of miR - 145 in MM cell lines H929 , MM1S and RPMI - 8226 was detected by RT - qPCR . After preliminary results , the expression of miR - 145 was detected in MM patients and normal volunteers .
The expression of miR - 145 was transiently transfected into MM cell H929 by RT - qPCR .
The proliferation of miR - 145 cells and the ability of cell clone formation were detected by the MTT method and the incorporation assay .
The expression of cyclin D1 and p21 protein was detected by flow cytometry and Western blot .
TUNEL , ELISA and Western blot were used to detect the Caspase activity in H929 cells and the expression of Bcl - 2 and Survivin in H929 cells after 48h .
Effect of miR - 145 on invasion and migration of H929 cells by Transwell invasion and migration experiments
The secretion of VEGF by miR - 145 was detected by ELISA .
The effects of miR - 145 on the expression of MMP - 2 and MMP - 9 in the family of MMP - 2 and MMP - 9 were detected by Western blot .
Western blot was used to detect the signaling pathway and MAPK signal pathway related protein expression in miR - 145 group , and further study the mechanism of miR - 145 on the proliferation and apoptosis of MM cells .
In vivo experiments , the expression of miR - 145 was detected by RT - qPCR and the expression of miR - 145 was detected by RT - qPCR . The apoptosis of MM cells in mice was analyzed by TUNEL method .

Results :

The expression level of miR - 145 in MM cell line H929 , MM1S and RPMI - 8226 was lower than that of normal volunteers . The expression level of miR - 145 in 25 MM patients with MM was significantly lower than that of normal volunteers , i.e . , miR - 145 was generally low in MM cell line and MM patients .
The transfection efficiency was verified by RT - qPCR .
Compared with the negative control group , the activity of the miR - 145 overexpression group was significantly lower than that of the negative control group , and the difference between the 4th and 5th day was more significant ( p < 0.01 ) .
The results of the experiment were consistent with the MTT assay , that is , the ability to clone the MM cells of the miR - 145 overexpression group was significantly reduced .
The results showed that the cell population of miR - 145 was significantly increased in G1 phase , while the percentage of S phase cells decreased greatly , and the percentage of G2 / M phase cells decreased significantly , suggesting that miR - 145 mainly caused the cell cycle arrest to affect the proliferation of cells in G1 phase .
The mechanism of cell cycle arrest was further studied . The expression of cyclin D1 and p21 was detected by Western blot . The results showed that the level of cyclin D1 was significantly decreased in the expression of miR - 145 , and the level of p21 protein was significantly increased .
TUNEL assay showed that the apoptosis of miR - 145 overexpression group was significantly increased .
The expression level of Bcl - 2 protein and Survivin protein in the H929 cell group detected by Western blot was significantly decreased , suggesting that the mechanism of miR - 145 could be correlated with the down - regulation of Bcl - 2 protein and Survivin protein .
Transwell invasion experiments and migration experiments showed that the number of cells passing through the membrane in the miR - 145 overexpression group was significantly lower than that in the negative control group compared with the number of cells migrating out of the cells ;
ELISA showed that miR - 145 overexpression group could significantly inhibit the secretion of VEGF in H929 cells .
Western blot showed that the expression of MMP - 2 and MMP - 9 in miR - 145 overexpression group was significantly decreased .
Western blot was used to detect the expression of phosphorylated PI3 - 3 in the miR - 145 group , and the total protein content was unchanged in the miR - 145 group .
In vivo experiments , the tumor volume in the miR - 145 overexpression group was decreased , the weight was reduced , the concentration of VEGF was decreased , and the number of apoptotic cells increased significantly .

Conclusion :

miR - 145 is a tumor suppressor gene of multiple myeloma , and miR - 145 mainly inhibits the proliferation of MM cells by inhibiting the activity of a 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - 3 - kinase / 2 - miR - 145 , promotes apoptosis , and further confirms the negative regulation effect of miR - 145 on MM tumor proliferation by using MM mice ;
Up - regulation of miR - 145 expression can inhibit the migration and invasion of MM cells , and the mechanism is related to the inhibition of VEGF secretion and the expression of MMP - 2 and MMP - 9 ;
Therefore , miR - 145 is likely to be an important potential target in MM treatment , and the relationship between miR - 145 and MM has important theoretical and clinical value .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.3

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本文編號(hào)：1859839