本文選題：肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞 + 懸浮培養(yǎng)　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:探索獲取肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的方法并觀察其生物學(xué)特性及腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況。方法:1收集采用普通培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)與采用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞。2在倒置顯微鏡下觀察兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。3流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90、CD133、CD24的各自表達(dá)量。4SYBR GreenⅠReal-Time PCR方法檢測(cè)兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90、CD133、CD24對(duì)應(yīng)的m RNA表達(dá)水平的變化情況。5將兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞各自注射入不同的裸鼠皮下,觀察并記錄種植瘤的體積,依此比較兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤細(xì)胞的致瘤能力及體內(nèi)增殖能力。結(jié)果:1兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。倒置顯微鏡下觀察到貼壁培養(yǎng)的SMMC-7721腫瘤細(xì)胞呈鋪路石樣生長(zhǎng),排列規(guī)整。而懸浮培養(yǎng)后SMMC-7721腫瘤細(xì)胞逐漸由單細(xì)胞聚集、增殖成球狀或類(lèi)球狀。2應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90、CD133、CD24的各自表達(dá)量比較。結(jié)果顯示:懸浮培養(yǎng)組中CD90(571.77±8.70)、CD24(233.56±10.85)的表達(dá)量明顯高于貼壁培養(yǎng)組(19.15±0.54、17.37±0.15),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CD90 t=-109.80 P=0.00;CD24 t=-34.51 P=0.00),但CD133在懸浮培養(yǎng)組(1.42±0.61)與貼壁培養(yǎng)組(1.48±1.09)中的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.08 P=0.94)。3兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90、CD133、CD24對(duì)應(yīng)的m RNA表達(dá)水平的變化情況。3.1RNA的鑒定紫外線(xiàn)下觀察可見(jiàn)有兩條明亮的條帶,分別對(duì)應(yīng)于28S和18S RNA,另外有一條較暗淡的5S條帶。28S和18S條帶的光密度值之比約為(1.5~2):1,并且未見(jiàn)RNA彌散帶,表明RNA完整性良好。3.2m RNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果Real-Time PCR結(jié)果顯示,CD90、CD24、CD133基因均有擴(kuò)增,擴(kuò)增曲線(xiàn)均進(jìn)入平臺(tái)期,熔解曲線(xiàn)呈標(biāo)準(zhǔn)的單峰,無(wú)雜峰出現(xiàn),表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異。若貼壁培養(yǎng)組m RNA的表達(dá)量設(shè)定為1,則懸浮培養(yǎng)組的CD90、CD24、CD133m RNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.72±0.19、1.72±0.19、1.05±0.03。兩組相比,懸浮培養(yǎng)后細(xì)胞的腫瘤表面標(biāo)志物CD90、CD24的m RNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于貼壁培養(yǎng)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CD90t=-6.55 P=0.02,CD24 t=-6.71 P=0.00),而貼壁培養(yǎng)組的CD133m RNA表達(dá)量相比懸浮培養(yǎng)組的無(wú)明顯差異(t=-3.41 P=0.08)。4比較兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤細(xì)胞致瘤性及體內(nèi)增殖能力。根據(jù)隔天測(cè)量皮下注射兩種方法培養(yǎng)的SMMC-7721的裸鼠腫瘤長(zhǎng)(a,單位mm)、寬(b,單位mm),按ab2/2計(jì)算出的體積(V,單位mm3)大小(貼壁培養(yǎng)組腫瘤細(xì)胞裸鼠皮下注射后2天:71.23±51.44,4天:60.08±24.33,6天:45.14±15.24,8天:32.56±10.16,10天:31.73±7.01,12天:26.41±13.95,14天:26.95±14.14;懸浮培養(yǎng)組腫瘤細(xì)胞裸鼠皮下注射后2天:60.17±47.93,4天:41.09±19.37,6天:32.90±14.13,8天:74.87±27.54,10天:97.30±37.63,12天:209.06±138.40,14天:294.69±250.65),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示兩組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.76,P=0.01),說(shuō)明兩組皮下腫瘤致瘤性及體內(nèi)增殖能力有差別。而測(cè)量時(shí)間與培養(yǎng)方式之間存在交互作用(F=6.18,P=0.03),隨著測(cè)量時(shí)間的延長(zhǎng),懸浮培養(yǎng)組所致的皮下腫瘤體積變化趨勢(shì)呈從開(kāi)始注射后2天到注射后6天為減小(2天:60.17±47.93,4天:41.09±19.37,6天:32.90±14.13),6天后大幅增高(8天:74.87±27.54,10天:97.30±37.63,12天:209.06±138.40,14天:294.69±250.65),貼壁培養(yǎng)組皮下腫瘤體積變化趨勢(shì)則呈緩慢減小后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)(2天:71.23±51.44,4天:60.08±24.33,6天:45.14±15.24,8天:32.53±10.16,10天:31.73±7.01,12天:26.41±13.95,14天:26.95±14.14)。說(shuō)明懸浮培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增值能力強(qiáng)于貼壁培養(yǎng)的。且貼壁培養(yǎng)組編號(hào)4的裸鼠在皮下注射腫瘤細(xì)胞14天內(nèi)皮下腫瘤體積逐漸縮小至未觸及,結(jié)果提示懸浮培養(yǎng)組比貼壁培養(yǎng)組致瘤性更強(qiáng)。結(jié)論:1懸浮培養(yǎng)后人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721部分細(xì)胞獲得了與腫瘤干細(xì)胞相似的部分特性,即為肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。2經(jīng)過(guò)懸浮培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞中表達(dá)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90、CD24的量明顯比貼壁培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞多,且所對(duì)應(yīng)的m RNA相對(duì)表達(dá)量也是相應(yīng)增高的。但CD133及其對(duì)應(yīng)的m RNA表達(dá)效果在兩種培養(yǎng)方法的腫瘤細(xì)胞中無(wú)明顯差別。因此,懸浮培養(yǎng)后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞中可能存在肝癌干細(xì)胞,但肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物仍需進(jìn)一步篩選及確定。3兩種不同培養(yǎng)方法處理的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞對(duì)裸鼠的致瘤性及體內(nèi)增殖能力有明顯差異。懸浮培養(yǎng)法與貼壁培養(yǎng)法相比,處理后的腫瘤細(xì)胞致瘤性及體內(nèi)增殖能力更強(qiáng),再次說(shuō)明懸浮培養(yǎng)后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞中可能存在肝癌干細(xì)胞。但懸浮培養(yǎng)法是否可作為獲取肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞首選的研究方法仍需進(jìn)一步討論。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of CD90 , CD133 and CD24 in human liver cancer cell line 7721 . The expression of CD90 , CD133 and CD24 in human liver cancer cell line 7721 was detected by flow cytometry . The results showed that the expression of CD90 , CD133 and CD24 in human liver cancer cell lines after treatment was significantly higher than that in adherent culture group ( 19.15 鹵 0.54 , 17.37 鹵 0.15 ) . There was no significant difference between the two groups ( F = 11.76 , P = 0 . 03 ) . There was a significant difference between the two groups ( F = 11.76 , P = 0 . 03 ) . Conclusion : 1 . The expression of CD90 and CD24 in tumor cells of human liver cancer cells transfected by suspension culture is much higher than that of adherent culture .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1851661