本文選題：肝細(xì)胞癌 + Annexin��； 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC,簡稱肝癌)是我國最常見的致命性惡性腫瘤之一,其病死率居惡性腫瘤死因的第二位。手術(shù)切除仍然是是目前原發(fā)性肝癌治療的首選治療方式,但是約有70%的患者術(shù)后會出現(xiàn)肝內(nèi)復(fù)發(fā)或肝外的轉(zhuǎn)移,其中大多數(shù)發(fā)生術(shù)后早期,這是直接導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不佳的最主要原因。因此,尋找切實(shí)有效的預(yù)測肝癌早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的生物分子標(biāo)記,闡明其與肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及相關(guān)分子機(jī)制,并以此為靶點(diǎn)進(jìn)行針對性干預(yù)治療,對于改善患者預(yù)后具有重要意義。Annexin A4蛋白屬于膜聯(lián)蛋白Annexins家族一員。目前大量研究證實(shí)其在卵巢癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、胰腺癌等多種腫瘤異常表達(dá),與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我們課題組前期開展的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果顯示,Annexin A4蛋白與肝癌近期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān),查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其在肝癌中研究較少,而且具體作用機(jī)制如何還不明確。目的:1、檢測Annexin A4蛋白在不同時期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者肝癌組織中的表達(dá),結(jié)合臨床病理資料,評價其對肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)期預(yù)后的預(yù)測價值;2、研宄Annexin A4基因過表達(dá)或沉默對于肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期以及遷移侵襲等生物學(xué)行為的影響;3、初步探討Annexin A4促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移可能的分子機(jī)制。方法:1、收集141例手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的臨床肝癌組織標(biāo)本,根據(jù)肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時間將其分為1年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組,1~2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組以及2年內(nèi)未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組,采用Q-PCR、Western blot、組織芯片及免疫組化技術(shù)檢測Annexin A4在不同分組肝癌組織中的表達(dá),結(jié)合臨床病理資料及隨訪信息,研究Annexin A4與臨床病理特征的相關(guān)性,探討其對肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及總體生存率的預(yù)測價值;2、Q-PCR和Western blot檢測Annexin A4在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系中的表達(dá);采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和sh RNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù),構(gòu)建Annexin A4基因過表達(dá)和穩(wěn)定沉默的肝癌細(xì)胞系;CCK-8、流式細(xì)胞術(shù),Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測Annexin A4基因過表達(dá)或沉默對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期以及遷移侵襲等生物學(xué)行為的影響;裸鼠皮下成瘤以及原位移植(腫瘤組織接種到肝臟)實(shí)驗(yàn),在體觀察Annexin A4基因過表達(dá)和沉默對肝癌細(xì)胞致瘤能力以及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響;3、比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析Annexin A4基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或沉默后肝癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化,篩選與目的基因關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)。Q-PCR和Western blot對所獲得的差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,初步探討Annexin A4基因介導(dǎo)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。結(jié)果:1、Q-PCR和Western blot結(jié)果顯示Annexin A4在1年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和1~2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組的肝癌組織中m RNA及蛋白表達(dá)水平較2年內(nèi)未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組均有顯著上調(diào)(P0.05),與我們此前的蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果一致。構(gòu)建包含141例臨床肝癌組織樣本的組織芯片,免疫組化檢測并結(jié)合臨床病理資料分析,結(jié)果表明Annexin A4高表達(dá)與門靜脈癌栓(P=0.03)及更高的BCLC分期(P=0.002)等侵襲性臨床病理特征相關(guān),而與年齡、性別、血清AFP水平、HBV-DNA、肝硬化、腫瘤分化程度、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑大小、腫瘤包膜無關(guān)(P均0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明高表達(dá)Annexin A4患者具有更高的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率(Log-rank test,P0.001)及更差的總體生存率(Log-rank test,P0.001)。COX多因素分析顯示Annexin A4是一個影響肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)(P=0.032)與總體生存(P=0.009)的獨(dú)立危險因素。2、Q-PCR和Western blot結(jié)果表明Annexin A4在不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系中表達(dá)存在差異,其在低轉(zhuǎn)移潛能的Hep G2細(xì)胞中表達(dá)量最低,在高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC-97H細(xì)胞中表達(dá)量最高。在此基礎(chǔ)上,利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RNAi技術(shù)成功構(gòu)建高表達(dá)Annexin A4的Hep G2細(xì)胞和穩(wěn)定沉默Annexin A4表達(dá)的MHCC-97H細(xì)胞,細(xì)胞功能學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示,在Hep G2細(xì)胞中上調(diào)Annexin A4表達(dá)能顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的體外遷移與侵襲能力,在MHCC-97H細(xì)胞中下調(diào)Annexin A4表達(dá)肝癌細(xì)胞的體外遷移與侵襲能力顯著降低,而Annexin A4過表達(dá)或沉默對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期等生物學(xué)行為無明顯影響;裸鼠皮下瘤以及原位移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沉默Annexin A4表達(dá)不影響MHCC-97H細(xì)胞的皮下腫瘤生長速度,但可抑制肝內(nèi)種植瘤發(fā)生遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移。本研究中未觀察到Annexin A4基因過表達(dá)對Hep G2細(xì)胞體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移的影響,考慮與ATCC來源的Hep G2細(xì)胞較差的致瘤性及較低的轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。3、蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析結(jié)果顯示,Annexin A4基因的過表達(dá)或沉默引起一系列相關(guān)蛋白在數(shù)量和表達(dá)水平上發(fā)生相應(yīng)的變化,其中包括N-Cadherin和Vimentin:過表達(dá)Annexin A4的Hep G2細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比,N-Cadherin和Vimentin表達(dá)水平分別上調(diào)1.85倍和1.53倍;沉默Annexin A4的MHCC-97H細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比,N-Cadherin和Vimentin分別下調(diào)了0.45倍和0.39倍,這一結(jié)果提示Annexin A4可能誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),Hep G2細(xì)胞過表達(dá)Annexin A4后,細(xì)胞由多邊形向梭形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變,而MHCC-97H細(xì)胞沉默Annexin A4表達(dá)后,細(xì)胞出現(xiàn)從梭形的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)向鵝卵石型的上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。Q-PCR和Western blot結(jié)果顯示過表達(dá)Annexin A4的Hep G2細(xì)胞中,N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào),而E-cadherin表達(dá)下降,伴有EMT轉(zhuǎn)錄因子Zeb1的表達(dá)增加。而與之相反的是,干擾Annexin A4表達(dá)的MHCC-97H細(xì)胞中,N-cadherin和Vimentin表達(dá)下降,而E-cadherin表達(dá)升高,同時伴有轉(zhuǎn)錄因子Zeb1的表達(dá)下調(diào)。而其他EMT轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Snail、Slug、Twist等,隨著Annexin A4基因表達(dá)的改變其表達(dá)水平未見明顯變化。結(jié)論:1、Annexin A4異常高表達(dá)與肝癌患者的術(shù)后預(yù)后密切相關(guān),可以作為一個評估肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的腫瘤分子標(biāo)記物;2、Annexin A4對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期等生物學(xué)行為無明顯影響,但可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力;3、Annexin A4可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Zeb1的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,但是Annexin A4具體通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)控Zeb1有待后續(xù)進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Objective : To investigate the relationship between tumor recurrence and metastasis of hepatocellular carcinoma ( HCC ) in the early stage of liver cancer . The results were as follows : 1 銆，

本文編號：1845675