發(fā)布時(shí)間：2018-05-04 21:49

  本文選題：TRIM59 + p53　； 參考：《南昌大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分TRIM59促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌增殖和遷移研究目的:TRIM家族是一類在炎癥、免疫、抗病毒和癌癥發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用超家族蛋白。作為TRIM家族的一員,之前有文獻(xiàn)報(bào)道TRIM59通過泛素化p53促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展,但是TRIM59在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的生理學(xué)功能和作用機(jī)制并不清楚。本課題通過QPCR方法,得到TRIM蛋白家族成員在非小細(xì)胞肺癌中的m RNA表達(dá)情況。進(jìn)一步探討TRIM59對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長、遷移和細(xì)胞周期的影響及其作用機(jī)制。研究方法:1、用QPCR方法篩選4株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(H1299,A549,SPC-A1和H292)相對(duì)于正常人類支氣管上皮細(xì)胞(HBE)中差異表達(dá)的TRIM基因。2、在蛋白水平上驗(yàn)證各株細(xì)胞中TRIM59表達(dá)情況,并且檢測(cè)其在14種人類正常組織中的表達(dá)情況。3、在轉(zhuǎn)染TRIM59特異性si RNA情況下,通過飽和密度實(shí)驗(yàn)、低血清實(shí)驗(yàn)、克隆集落形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光實(shí)驗(yàn),檢測(cè)干擾TRIM59表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長、遷移和細(xì)胞周期的影響。4、降低TRIM59表達(dá)水平,然后進(jìn)行QPCR實(shí)驗(yàn),免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn),檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白和p53蛋白表達(dá)情況。研究結(jié)果:1、相比于HBE細(xì)胞,在4株NSCLC細(xì)胞中TRIM3、TRIM7、TRIM14、TRIM16、TRIM21、TRIM22、TRIM29、TRIM59、TRIM66和TRIM70高表達(dá),TRIM4、TRIM9、TRIM36、TRIM46、TRIM54、TRIM67和TRIM76低表達(dá)。而TRIM17、TRIM40、TRIM42、TRIM43、TRIM48、TRIM49、TRIM50、TRIM51、TRIM60、TRIM63、TRIM64和TRIM77在NSCLC細(xì)胞和HBE細(xì)胞中未檢測(cè)到。2、相比于HBE細(xì)胞,TRIM59蛋白在4株NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)。TRIM59在骨髓和脾臟中高表達(dá),在肺和肌肉中低表達(dá),而在其它正常組織(脂肪、血液、直腸、心臟、腎臟、肝臟、淋巴結(jié)、皮膚、胃和睪丸)中未檢測(cè)到。3、干擾TRIM59蛋白表達(dá)明顯抑制NSCLC細(xì)胞生長、克隆集落形成、遷移,并且G2/M期細(xì)胞增多,PCNA蛋白表達(dá)降低。4、干擾TRIM59蛋白表達(dá),細(xì)胞周期蛋白CDC2、CCNA2、CCNB1、CCNB2和CDC25C的m RNA水平降低,其中CDC2和CDC25C蛋白水平也降低,而CCNB1的蛋白水平?jīng)]有變化。在4株NSCLC細(xì)胞和HBE細(xì)胞中干擾TRIM59表達(dá),發(fā)現(xiàn)H1299細(xì)胞中未檢測(cè)到p53表達(dá),HBE、H292和A549細(xì)胞中p53表達(dá)沒有改變,而在SPC-A1細(xì)胞中p53蛋白水平有所降低。研究結(jié)論:1、TRIM59在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá),并且促進(jìn)NSCLC細(xì)胞生長、克隆集落形成和遷移。2、TRIM59促進(jìn)NSCLC細(xì)胞從DNA合成后期進(jìn)入細(xì)胞分裂期,并且上調(diào)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。3、TRIM59并非通過p53信號(hào)通路來影響NSCLC細(xì)胞的生理學(xué)行為。第二部分COMMD9在非小細(xì)胞肺癌中與TFDP1結(jié)合促進(jìn)TFDP1/E2F1轉(zhuǎn)錄活性研究目的:COMMD家族是在炎癥、銅離子代謝、鈉離子穩(wěn)態(tài)、胞內(nèi)分選和癌癥中發(fā)揮重要作用的一類蛋白家族。文獻(xiàn)報(bào)道COMMD9可能與TFDP1有相互作用,但是還未驗(yàn)證,并且COMMD9在癌癥中的作用還未見報(bào)道。本課題的研究目的是探討COMMD9對(duì)非小細(xì)胞肺癌生長、遷移、細(xì)胞周期和自噬的影響,檢測(cè)COMMD9和TFDP1是否有相互作用及作用形式,并且是否對(duì)TFDP1/E2F1轉(zhuǎn)錄活性有影響。研究方法:1、用QPCR方法篩選4株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(H1299,A549,SPC-A1和H292)相對(duì)于正常人類支氣管上皮細(xì)胞(HBE)中COMMD家族差異表達(dá)基因。用免疫蛋白印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)COMMD9蛋白在NSCLC細(xì)胞和組織中的表達(dá)情況。2、用si RNA干擾COMMD9表達(dá),通過結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)、克隆集落形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)降低COMMD9表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長、遷移、細(xì)胞周期和自噬的影響。3、構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒,通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究COMMD9和TFDP1相互作用及作用結(jié)構(gòu)域。4、干擾COMMD9表達(dá),采用熒光素酶報(bào)告基因、QPCR和Western blot方法,檢測(cè)TFDP1/E2F1轉(zhuǎn)錄活性變化,以及p53信號(hào)通路的改變。研究結(jié)果:1、相比于HBE細(xì)胞,在4株NSCLC細(xì)胞中COMMD3、COMMD4、COMMD5和COMMD8的m RNA水平低表達(dá),而COMMD9的m RNA和蛋白水平都高表達(dá)。NSCLC組織中COMMD9蛋白表達(dá)高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。2、干擾COMMD9表達(dá)明顯抑制NSCLC細(xì)胞生長、克隆集落形成、遷移,阻滯細(xì)胞G1期到S期的進(jìn)程,并且促進(jìn)自噬的發(fā)生。3、成功構(gòu)建COMMD9和TFDP1全長以及截短的表達(dá)質(zhì)粒,COMMD9可以和TFDP1發(fā)生相互作用。COMMD9的COMM結(jié)構(gòu)域和TFDP1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是這兩個(gè)蛋白相互作用的主要結(jié)合區(qū)域。4、干擾COMMD9表達(dá)抑制TFDP1/E2F1轉(zhuǎn)錄活性及下游基因的表達(dá),并且p53蛋白水平上調(diào),p53下游基因的表達(dá)也受到影響。研究結(jié)論:1、COMMD9在NSCLC中高表達(dá),并且促進(jìn)NSCLC細(xì)胞生長、克隆集落形成、遷移,促進(jìn)細(xì)胞周期從DNA合成前期進(jìn)入DNA合成期,并且抑制細(xì)胞自噬。2、COMMD9通過COMM結(jié)構(gòu)域與TFDP1結(jié)合,并且TFDP1中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ谶@兩個(gè)蛋白的相互作用是必需的。3、COMMD9促進(jìn)TFDP1/E2F1轉(zhuǎn)錄活性,并且抑制p53信號(hào)通路。
[Abstract]:The first part TRIM59 promotes the proliferation and migration of non-small cell lung cancer: the TRIM family is an important class of superfamily proteins in the process of inflammation, immunity, antiviral and cancer development. As a member of the TRIM family, it has been reported that TRIM59 has promoted the development of gastric cancer by ubiquitination of p53, but TRIM59 is not small. The physiological function and mechanism of cell lung cancer (NSCLC) is not clear. This subject has obtained the m RNA expression of TRIM protein family in non-small cell lung cancer by means of QPCR method. The effect of TRIM59 on the growth, migration and cell cycle of non-small cell lung cancer and its mechanism of action are further discussed. 1, TRIM59 screening with QPCR method TRIM gene.2 differentially expressed in 4 non small cell lung cancer cells (H1299, A549, SPC-A1 and H292) compared with normal human bronchial epithelial cells (HBE). The expression of TRIM59 in each cell was verified at the protein level, and the expression of the TRIM was detected in the 14 normal human tissues, and the expression of TRIM59 was detected in the specific Si RNA of TRIM59. The supersaturation density experiment, the low serum experiment, the clone colony formation experiment, the scratch test, the Transwell experiment, the flow cytometry and the immunofluorescence test, detect the effect of interference TRIM59 expression on the growth, migration and cell cycle of non small cell lung cancer cells.4, reduce the expression level of TRIM59, and then carry out QPCR test, immunoblotting experiment and detection. Cell cycle protein and p53 protein expression. 1, compared to HBE cells, TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, in the 4 NSCLC cells 0, TRIM63, TRIM64 and TRIM77 were not detected in NSCLC cells and HBE cells. Compared to HBE cells, TRIM59 protein expressed high expression in 4 strains of NSCLC cells in bone marrow and spleen, low expression in the lungs and muscles, but not in other normal tissues (fat, blood, straight intestine, heart, kidney, liver, lymph node, skin, stomach, and testicle) The expression of TRIM59 protein inhibited the growth of NSCLC cells, cloned colony formation, migration, and G2/M cell growth, PCNA protein expression decreased.4, interfered the expression of TRIM59 protein, cyclin CDC2, CCNA2, CCNB1, CCNB2 and CDC25C. The expression of TRIM59 was disturbed in 4 NSCLC cells and HBE cells, and the expression of p53 was not detected in the H1299 cells. The p53 expression in HBE, H292 and A549 cells was not changed, but the p53 protein level in the SPC-A1 cells decreased. The conclusion: 1, TRIM59 was highly expressed in the cells and promoted the colony formation. The formation and migration of.2, TRIM59 promotes NSCLC cells to enter the cell division phase from the late stage of DNA synthesis, and up regulation of the expression of cyclin.3, TRIM59 does not affect the physiological behavior of NSCLC cells through p53 signaling. Second part COMMD9 in non-small cell lung cancer and TFDP1 binding to promote TFDP1/E2F1 transcriptional activity research: COMMD home The family is a family of proteins that play an important role in inflammation, copper ion metabolism, sodium ion homeostasis, intracellular separation and cancer. The literature reports that COMMD9 may interact with TFDP1 but has not been verified, and the role of COMMD9 in cancer has not yet been reported. The purpose of this study is to explore the growth and migration of COMMD9 for non-small cell lung cancer. Migration, cell cycle and autophagy, whether COMMD9 and TFDP1 have interaction and action form, and whether it affects TFDP1/E2F1 transcriptional activity. 1, screening 4 non small cell lung cancer cells (H1299, A549, SPC-A1 and H292) with the QPCR method for the COMMD family difference table in normal human bronchial epithelial cells (HBE). The expression of COMMD9 protein in NSCLC cells and tissues was detected by immunoblotting (Western blot),.2 expression in NSCLC cells and tissues was detected by Si RNA, by crystal violet staining, cloned colony formation experiment, soft agar test, scratch test, Transwell experiment, flow cytometry and Western blot experiment to detect reduced COMMD9 table. The effect of.3 on the growth, migration, cell cycle and autophagy of non-small cell lung cancer cells, the construction of related plasmids, the interaction of COMMD9 and TFDP1 and the function domain.4, interfering COMMD9 expression by immunoprecipitation experiment, using luciferase reporter gene, QPCR and Western blot method to detect the change of TFDP1/E2F1 transcriptional activity and p53 letter. 1, compared to HBE cells, the levels of M RNA, COMMD4, COMMD5 and COMMD8 in 4 NSCLC cells were low, while COMMD9 m RNA and protein levels were highly expressed in.NSCLC tissues. Migrate, block the process of G1 phase to S phase, and promote the occurrence of autophagy by.3, successfully construct COMMD9 and TFDP1 full length and a truncated expression plasmid, COMMD9 can interact with TFDP1 in.COMMD9's COMM domain and TFDP1 DNA binding domain is the main binding region of the two proteins interacting with.4, interference expression Inhibition of TFDP1/E2F1 transcriptional activity and expression of downstream genes, and up regulation of p53 protein levels, and the expression of the downstream p53 genes are also affected. Conclusions: 1, COMMD9 is highly expressed in NSCLC, and promotes the growth of NSCLC cells, colony formation and migration, promotes cell cycle from the early stage of DNA synthesis into DNA synthesis, and inhibits autophagy. 2, COMMD9 is combined with TFDP1 through the COMM domain, and the interaction of DNA in TFDP1 domain for these two proteins is essential.3, COMMD9 promotes TFDP1/E2F1 transcriptional activity and inhibits p53 signaling pathways.

【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：1844801