本文選題：非小細(xì)胞型肺癌 + 間變性淋巴瘤激酶　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：肺癌是世界上發(fā)病率及癌癥相關(guān)死亡率最高的惡性腫瘤,其中85%為非小細(xì)胞肺癌,絕大多數(shù)肺癌患者在診斷時(shí)已屬晚期,早期發(fā)現(xiàn)的肺癌患者,即使是經(jīng)過(guò)正規(guī)的治療,其5年生存率僅為17%,發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期患者的5年生存率則僅為4%。因此如何更有效的治療肺癌,延長(zhǎng)癌癥患者的生存期無(wú)疑是目前研究的熱點(diǎn)。癌癥的個(gè)體化治療無(wú)疑是肺癌治療最有效的方法,該方法是基于患者腫瘤基因?qū)W特征制定治療方案。ALK抑制劑克唑替尼的發(fā)明及應(yīng)用就是一個(gè)成功治療非小細(xì)胞肺癌例子,其可以極大的改善ALK基因突變型肺癌患者的預(yù)后�？诉蛱婺崾且环N具有多種酪氨酸激酶活性的抑制劑,包括MET、ALK及ROS1,其可以作為分子靶向藥物用于治療ALK陽(yáng)性的晚期非小細(xì)胞肺癌,臨床實(shí)驗(yàn)表明,接受克唑替尼治療的患者客觀緩解率(ORR)接近60%,另一項(xiàng)研究則達(dá)到了50%的ORR,基于此,FDA批準(zhǔn)克唑替尼用于治療ALK陽(yáng)性的肺癌患者。近期,PROFILE 1014臨床實(shí)驗(yàn)評(píng)估了一線化療方案培美曲塞聯(lián)合鉑類與克唑替尼單藥治療晚期ALK陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌患者,結(jié)果顯示克唑替尼有著更顯著的PFS、ORR,副作用更少。因此,目前克唑替尼靶向治療ALK陽(yáng)性肺癌患者被推薦為治療該種肺癌的一線治療方案。不幸的是,向應(yīng)用其他抗腫瘤藥物一樣,所有患者接受克唑替尼治療的過(guò)程中耐藥的出現(xiàn)無(wú)可避免,該時(shí)間通常在1年之內(nèi),耐藥機(jī)制較復(fù)雜。因此尋找一種可以增加常規(guī)治療如化療,放療,分子靶向治療的敏感性的方法,延緩耐藥的發(fā)生是目前解決腫瘤耐藥的一種新的途徑。mi R-200c作為mi R-200家族中的代表,在很多腫瘤組織中低表達(dá),能夠調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,在間質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)mi R-200c能夠促使間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化�？梢栽鴱�(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物、EGFR-TKI藥物及放療的敏感性,但是,mi R-200是否可以提高ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞對(duì)克唑替尼的敏感性尚未可知,本研究旨在研究mi R-200c調(diào)節(jié)ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞對(duì)克唑替尼敏感性的作用,并試探討其作用機(jī)制。第一部分克唑替尼對(duì)H2228,A549及H460肺癌細(xì)胞株增殖和遷移的影響目的:檢測(cè)克唑替尼藥物對(duì)包括ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞在內(nèi)的不同肺癌細(xì)胞系增殖和遷移的影響,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。方法:H2228細(xì)胞系,為EML4-ALK融合基因陽(yáng)性肺腺癌細(xì)胞,購(gòu)于ATCC(American Type Culture Collection)公司;A549(肺腺癌細(xì)胞株)及H460(人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌株)兩種細(xì)胞系由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所贈(zèng)送。將細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中,其中含有10%的胎牛血清,常規(guī)置于37℃、5%CO2、100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。應(yīng)用四甲基噻唑藍(lán)法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)3種肺癌細(xì)胞系H2228,A549和H460在不同濃度(0,25,50,100,200nmol/L)的克唑替尼下增殖活性變化。同樣地,檢測(cè)H2228細(xì)胞系在100nmol/L時(shí)不同時(shí)間(0,24,48,72h)下的增殖情況。Transwell小室方法檢測(cè)克唑替尼對(duì)H2228,A549和H460細(xì)胞遷移活性的影響。將H2228,A549和H460細(xì)胞用濃度為(0,25,50,100nmol/L)的克唑替尼處理48小時(shí)后,然后應(yīng)用Transwell小室法檢測(cè)。結(jié)果:1克唑替尼對(duì)H2228,A549及H460肺癌細(xì)胞增殖的影響分別用濃度為0,25,50,100,200nmol/L的克唑替尼處理H2228,A549及H460肺癌細(xì)胞48 h后,MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示:克唑替尼對(duì)ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞H2228增殖起抑制作用,并且隨著克唑替尼濃度的增加而增強(qiáng)(P0.05,P0.01),通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算IC50為:121.91nmol/L�？诉蛱婺釋�(duì)ALK突變陰性肺腺癌A549細(xì)胞及高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌株H460細(xì)胞的增殖抑制率較弱,只有較大劑量時(shí)200nmol/L才有輕微的抑制作用(22%和19.7%,P0.05)。用100 nmol/L的克唑替尼處理H2228細(xì)胞24,48和72 h,分別MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示:隨著克唑替尼作用時(shí)間的延長(zhǎng),克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)(P0.05)。綜上,這些結(jié)果說(shuō)明克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。2克唑替尼對(duì)H2228,A549及H460肺癌細(xì)胞遷移的影響Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:分別用濃度為0,25,50,100,200nmol/L的克唑替尼處理H2228,A549及H460肺癌細(xì)胞細(xì)胞48h,隨著克唑替尼濃度的增加,其對(duì)H2228細(xì)胞遷移活性抑制增強(qiáng)(P0.05,P0.01)。而對(duì)A549及H460細(xì)胞的抑制則無(wú)明顯增強(qiáng),結(jié)果表明:克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞侵襲存在劑量依賴性抑制作用。結(jié)論:克唑替尼作為ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞的分子靶向藥物,對(duì)肺癌H2228細(xì)胞的增殖、遷移起抑制作用,且該作用具有劑量和時(shí)間依賴性。第二部分mi R-200c對(duì)克唑替尼抑制H2228細(xì)胞增殖性及遷移的影響及機(jī)制目的:觀察mi R-200c對(duì)克唑替尼抑制H2228細(xì)胞增殖性及遷移的影響并試探討其機(jī)制。方法:H2228細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis,mi R-200c mimicis negative control(NC),mi R-200c inhibitor及mi R-200c inhibitor NC;MTT法分別檢測(cè)克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis、mi R-200c inhibitor H2228細(xì)胞增殖情況的影響;Transwell法檢測(cè)H2228細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis、mi R-200c inhibitor H2228細(xì)胞遷移情況;生物信息學(xué)網(wǎng)站及軟件查詢預(yù)測(cè)mi R-200c作用靶基因,雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證ZEB1為mi R-200c的靶基因;實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)H2228細(xì)胞及轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin及CD24的m RNA表達(dá)水平的變化;Western-blot技術(shù)檢測(cè)H2228細(xì)胞及轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:1 H2228肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis及陰性對(duì)照mimicis NC,轉(zhuǎn)染mi R-200c inhibitor及陰性對(duì)照inhibitor NC后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果為檢測(cè)mi R-200c對(duì)H2228細(xì)胞的影響,對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行mi R-200c mimicis,mi R-200c mimicis negative control(NC),mi R-200c inhibitor及mi R-200c inhibitor NC的轉(zhuǎn)染,我們發(fā)現(xiàn)H2228細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)mi R-200c的表達(dá)結(jié)果:mi R200c表達(dá)水平明顯增高,較陰性對(duì)照增高310倍,兩者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);相反,轉(zhuǎn)染mi R-200c inhibitor及陰性對(duì)照inhibitor NC后,mi R-200c表達(dá)水平則明顯降低,較陰性對(duì)照降低3.5倍,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2 micro RNA-200c增加H2228細(xì)胞對(duì)克唑替尼的敏感性分別用濃度為50n M、100n M及200n M的克唑替尼處理轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis及陰性對(duì)照mimicis NC的H2228細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后的細(xì)胞在以上各種濃度下,克唑替尼的抑制作用明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同樣,細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-200c inhibitor,抑制細(xì)胞mi R-200c表達(dá)后,克唑替尼在以上各種濃度下,對(duì)細(xì)胞的抑制作用較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05及P0.01)。3 micro RNA-200c抑制H2228細(xì)胞遷移能力我們同時(shí)應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis及陰性對(duì)照mimicis NC,轉(zhuǎn)染mi R-200c inhibitor及陰性對(duì)照inhibitor NC的H2228細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)細(xì)胞mi R-200c的表達(dá)后,細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制(P0.01),相反,抑制mi R-200c表達(dá)后,細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(P0.05)。4雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證ZEB1為mi R-200c的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果所示,Negative Control mi RNA轉(zhuǎn)染組(陰性對(duì)照組)、mi R-200c mimic轉(zhuǎn)染組ZEB1的相對(duì)熒光強(qiáng)度顯示,mi R-200c mimics轉(zhuǎn)染組能夠降低ZEB1相對(duì)熒光強(qiáng)度(P0.05)5 mi R-200c對(duì)H2228細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響通過(guò)q RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis及陰性對(duì)照mimicis NC的H2228細(xì)胞,其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的m RNA表達(dá)水平的不同。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis的H2228細(xì)胞,其N-cadherin,Vimentin,CD24的m RNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯減低(P0.05及P0.01),而E-cadherin的m RNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯增高(P0.01)。相應(yīng)的,應(yīng)用western blot分析方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis及陰性對(duì)照mimicis NC的H2228細(xì)胞,其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的蛋白表達(dá)水平的不同,發(fā)現(xiàn)與m RNA表示差異相似,轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis的H2228細(xì)胞,其N-cadherin,Vimentin,CD24的蛋白表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯減低(P0.05),而E-cadherin的蛋白表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯增高(P0.01)。結(jié)論:mi R-200c過(guò)表達(dá)可以通過(guò)調(diào)節(jié)ZEB1,使靶細(xì)胞發(fā)生EMT改變,可以增加ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞H2228對(duì)克唑替尼的敏感性并可以抑制H2228細(xì)胞的遷移性。第三部分:耐克唑替尼ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞株H2228/CR的培養(yǎng)及特點(diǎn)目的:通過(guò)對(duì)耐克唑替尼ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞株H2228/CR的培養(yǎng),進(jìn)一步了解耐藥細(xì)胞發(fā)生的變化并探討耐藥發(fā)生的機(jī)制。方法:體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法,建立H2228細(xì)胞對(duì)克唑替尼的耐藥細(xì)胞株H2228/CR;觀察ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞株H2228和其耐藥細(xì)胞株H2228/CR的形態(tài)學(xué)變化;MTT法檢測(cè)鑒定克唑替尼對(duì)H2228及其耐藥細(xì)胞株H2228/CR增殖活性的影響,計(jì)算H2228/CR細(xì)胞的IC50及耐藥倍數(shù):Transwell法分別檢測(cè)H2228及H2228/CR細(xì)胞的遷移率;RT-PCR方法檢測(cè)H2228及H222/8CR細(xì)胞N-cadherin,Vimentin,E-cadherin、ZEB1及ZEB2的m RNA表達(dá)差異;Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)H2228及H2228/CR細(xì)胞N-cadherin,Vimentin,E-cadherin、ZEB1及ZEB2的蛋白表達(dá)差異。結(jié)果:1耐克唑替尼細(xì)胞系H2228/CR對(duì)克唑替尼明顯耐藥經(jīng)過(guò)6個(gè)月余的培養(yǎng),我們最終獲得了耐藥細(xì)胞H2228/CR,該細(xì)胞可以在800n M濃度的克唑替尼藥物中生長(zhǎng)。低倍鏡下觀察H2228細(xì)胞及H2228/CR細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞形態(tài)學(xué)上明顯發(fā)生了變化,由橢圓形變?yōu)榧忓N形,細(xì)胞排列較松散。MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率發(fā)現(xiàn),克唑替尼對(duì)H2228/CR細(xì)胞的抑制作用明顯減弱,對(duì)親代H2228細(xì)胞的IC50為121.9n M對(duì)H2228/CR細(xì)胞的IC50為2618.45n M,耐藥增加了21.5倍。2耐藥細(xì)胞H2228/CR有著更高的侵襲力應(yīng)用Transwell法檢測(cè)H2228細(xì)胞及H2228/CR細(xì)胞的遷移率,我們發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的遷移率較親代細(xì)胞H2228明顯增高(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 H2228/CR細(xì)胞發(fā)生EMT改變?nèi)缟纤?H2228/CR細(xì)胞由橢圓形向紡錘形改變,排列較分散,提示可能存在間質(zhì)改變。用RT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)H2228CR細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的改變,檢測(cè)H2228/CR細(xì)胞的分在標(biāo)記物后發(fā)現(xiàn)其E-cadherin無(wú)論在m RNA水平還是在蛋白水平表達(dá)均較親代H2228細(xì)胞明顯減低,而N-cadherin,Vimentin,則在m RNA及蛋白水平均增高。結(jié)論:1耐克唑替尼藥物的ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞H2228/CR細(xì)胞培養(yǎng)成功,耐藥倍數(shù)為21.5倍,達(dá)到進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求。2耐藥細(xì)胞株H2228/CR較原始非耐藥細(xì)胞有著更明顯的侵襲性且發(fā)生了EMT改變。第四部分mi R-200c通過(guò)靶向調(diào)節(jié)ZEB1逆轉(zhuǎn)EMT增加耐克唑替尼H2228/CR細(xì)胞對(duì)克唑替尼的敏感性目的:耐克唑替尼細(xì)胞株H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c,研究轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移性及對(duì)克唑替尼藥物敏感性變化并探討機(jī)制。方法:RT-PCR方法檢測(cè)H2228細(xì)胞及H2228/CR細(xì)胞mi R-200c的表達(dá);H2228/CR細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis,mi R-200c mimicis negative control;MTT法分別檢測(cè)克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞及H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis、mi R-200c mimicis NC后細(xì)胞增殖抑制情況;Transwell法檢測(cè)H2228細(xì)胞及H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis、mi R-200c mimicis NC后細(xì)胞遷移情況;實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)H2228細(xì)胞及H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin及CD24的m RNA表達(dá)水平的變化;Western-blot方法檢測(cè)H2228細(xì)胞及轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:1 mi R-200c在耐藥細(xì)胞H2228/CR中表達(dá)較H2228細(xì)胞明顯降低應(yīng)用RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)H2228細(xì)胞及H2228/CR細(xì)胞的mi RNA-200c的表達(dá)發(fā)現(xiàn),與親代細(xì)胞H2228比較,耐藥細(xì)胞H2228/CR的mi R-200c減低23.4倍。2恢復(fù)表達(dá)mi R-200c后,H2228/CR細(xì)胞對(duì)克唑替尼敏感性增加H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis及陰性對(duì)照mimics-NC,RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果顯示,H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后其mi R-200c表達(dá)較H2228及H2228/CR陰性轉(zhuǎn)染明顯增高。MTT方法檢測(cè)克唑替尼對(duì)以上3種細(xì)胞的抑制情況發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis的H2228/CR細(xì)胞的增殖受克唑替尼的抑制較轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照mimicis NC組的細(xì)胞明顯增強(qiáng),但未恢復(fù)到克唑替尼對(duì)親代H2228細(xì)胞即耐藥前的抑制水平。3恢復(fù)表達(dá)mi R-200c后,H2228/CR細(xì)胞的遷移降低Transwell方法檢測(cè)H2228細(xì)胞及H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis、mi R-200c mimicis NC后細(xì)胞遷移情況發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis的H2228/CR細(xì)胞的遷移性較轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照mimicis NC組的細(xì)胞明顯減低,但仍高于親代H2228細(xì)胞的遷移率。4 mi R-200c逆轉(zhuǎn)H2228/CR細(xì)胞發(fā)生的EMT改變用RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)H2228細(xì)胞及轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis和轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis NC后H2228/CR細(xì)胞中N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的m RNA變化,我們發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis的H2228/CR細(xì)胞其E-cadherin的m RNA表達(dá)較陰性對(duì)照增高(P0.05),較親代H2228細(xì)胞減低更明顯(P0.01),而N-cadherin,Vimentin和CD24的m RNA表達(dá)較陰性對(duì)照明顯減低(P0.01),較親代H2228細(xì)胞增高(P0.05)。同樣,與m RNA表達(dá)相對(duì)應(yīng),應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)以上3中細(xì)胞相應(yīng)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis的H2228/CR細(xì)胞其E-cadherin的蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照增高(P0.05),但較親代H2228細(xì)胞減低(P0.01),而N-cadherin,Vimentin和CD24的蛋白表達(dá)表達(dá)較陰性對(duì)照明顯增高(P0.05),較親代H2228細(xì)胞增高更明顯(P0.01)。結(jié)論:1耐克唑替尼細(xì)胞H2228/CR其mi R-200c表達(dá)較親代明顯減低,恢復(fù)表達(dá)mi R-200c后,H2228/CR細(xì)胞對(duì)克唑替尼的敏感性增加,遷移率減低。2通過(guò)檢測(cè)相關(guān)m RNA及蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),mi R-200c是通過(guò)逆轉(zhuǎn)EMT過(guò)程而增加H2228/CR對(duì)克唑替尼的敏感性
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 胡麗麗;尹燕軍;鐘文娟;邱峰;;miR-200c增強(qiáng)肺癌A549細(xì)胞對(duì)紫杉醇及吉非替尼的敏感度及相關(guān)機(jī)制[J];腫瘤防治研究;2015年08期

2 陳雪姣;王朝杰;白冰;溫一陽(yáng);倉(cāng)順東;;克唑替尼治療1例晚期ALK陰性非小細(xì)胞肺癌的療效分析及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J];分子影像學(xué)雜志;2015年03期

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本文編號(hào)：1843070