本文選題：非小細胞型肺癌 + 間變性淋巴瘤激酶��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：肺癌是世界上發(fā)病率及癌癥相關(guān)死亡率最高的惡性腫瘤,其中85%為非小細胞肺癌,絕大多數(shù)肺癌患者在診斷時已屬晚期,早期發(fā)現(xiàn)的肺癌患者,即使是經(jīng)過正規(guī)的治療,其5年生存率僅為17%,發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期患者的5年生存率則僅為4%。因此如何更有效的治療肺癌,延長癌癥患者的生存期無疑是目前研究的熱點。癌癥的個體化治療無疑是肺癌治療最有效的方法,該方法是基于患者腫瘤基因?qū)W特征制定治療方案。ALK抑制劑克唑替尼的發(fā)明及應(yīng)用就是一個成功治療非小細胞肺癌例子,其可以極大的改善ALK基因突變型肺癌患者的預(yù)后�？诉蛱婺崾且环N具有多種酪氨酸激酶活性的抑制劑,包括MET、ALK及ROS1,其可以作為分子靶向藥物用于治療ALK陽性的晚期非小細胞肺癌,臨床實驗表明,接受克唑替尼治療的患者客觀緩解率(ORR)接近60%,另一項研究則達到了50%的ORR,基于此,FDA批準克唑替尼用于治療ALK陽性的肺癌患者。近期,PROFILE 1014臨床實驗評估了一線化療方案培美曲塞聯(lián)合鉑類與克唑替尼單藥治療晚期ALK陽性非小細胞肺癌患者,結(jié)果顯示克唑替尼有著更顯著的PFS、ORR,副作用更少。因此,目前克唑替尼靶向治療ALK陽性肺癌患者被推薦為治療該種肺癌的一線治療方案。不幸的是,向應(yīng)用其他抗腫瘤藥物一樣,所有患者接受克唑替尼治療的過程中耐藥的出現(xiàn)無可避免,該時間通常在1年之內(nèi),耐藥機制較復(fù)雜。因此尋找一種可以增加常規(guī)治療如化療,放療,分子靶向治療的敏感性的方法,延緩耐藥的發(fā)生是目前解決腫瘤耐藥的一種新的途徑。mi R-200c作為mi R-200家族中的代表,在很多腫瘤組織中低表達,能夠調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,在間質(zhì)細胞中過表達mi R-200c能夠促使間質(zhì)細胞向上皮細胞轉(zhuǎn)化�？梢栽鴱姺伟┘毎麑Χ喾N化療藥物、EGFR-TKI藥物及放療的敏感性,但是,mi R-200是否可以提高ALK陽性肺癌細胞對克唑替尼的敏感性尚未可知,本研究旨在研究mi R-200c調(diào)節(jié)ALK陽性肺癌細胞對克唑替尼敏感性的作用,并試探討其作用機制。第一部分克唑替尼對H2228,A549及H460肺癌細胞株增殖和遷移的影響目的:檢測克唑替尼藥物對包括ALK陽性肺癌細胞在內(nèi)的不同肺癌細胞系增殖和遷移的影響,為下一步實驗奠定基礎(chǔ)。方法:H2228細胞系,為EML4-ALK融合基因陽性肺腺癌細胞,購于ATCC(American Type Culture Collection)公司;A549(肺腺癌細胞株)及H460(人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌株)兩種細胞系由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所贈送。將細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中,其中含有10%的胎牛血清,常規(guī)置于37℃、5%CO2、100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中。應(yīng)用四甲基噻唑藍法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和細胞計數(shù)法檢測3種肺癌細胞系H2228,A549和H460在不同濃度(0,25,50,100,200nmol/L)的克唑替尼下增殖活性變化。同樣地,檢測H2228細胞系在100nmol/L時不同時間(0,24,48,72h)下的增殖情況。Transwell小室方法檢測克唑替尼對H2228,A549和H460細胞遷移活性的影響。將H2228,A549和H460細胞用濃度為(0,25,50,100nmol/L)的克唑替尼處理48小時后,然后應(yīng)用Transwell小室法檢測。結(jié)果:1克唑替尼對H2228,A549及H460肺癌細胞增殖的影響分別用濃度為0,25,50,100,200nmol/L的克唑替尼處理H2228,A549及H460肺癌細胞48 h后,MTT和細胞計數(shù)實驗的結(jié)果顯示:克唑替尼對ALK陽性肺癌細胞H2228增殖起抑制作用,并且隨著克唑替尼濃度的增加而增強(P0.05,P0.01),通過統(tǒng)計軟件計算IC50為:121.91nmol/L�？诉蛱婺釋LK突變陰性肺腺癌A549細胞及高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌株H460細胞的增殖抑制率較弱,只有較大劑量時200nmol/L才有輕微的抑制作用(22%和19.7%,P0.05)。用100 nmol/L的克唑替尼處理H2228細胞24,48和72 h,分別MTT和細胞計數(shù)的結(jié)果顯示:隨著克唑替尼作用時間的延長,克唑替尼對H2228細胞增殖的抑制作用逐漸增強(P0.05)。綜上,這些結(jié)果說明克唑替尼對H2228細胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性和時間依賴性。2克唑替尼對H2228,A549及H460肺癌細胞遷移的影響Transwell小室實驗結(jié)果顯示:分別用濃度為0,25,50,100,200nmol/L的克唑替尼處理H2228,A549及H460肺癌細胞細胞48h,隨著克唑替尼濃度的增加,其對H2228細胞遷移活性抑制增強(P0.05,P0.01)。而對A549及H460細胞的抑制則無明顯增強,結(jié)果表明:克唑替尼對H2228細胞侵襲存在劑量依賴性抑制作用。結(jié)論:克唑替尼作為ALK陽性肺癌細胞的分子靶向藥物,對肺癌H2228細胞的增殖、遷移起抑制作用,且該作用具有劑量和時間依賴性。第二部分mi R-200c對克唑替尼抑制H2228細胞增殖性及遷移的影響及機制目的:觀察mi R-200c對克唑替尼抑制H2228細胞增殖性及遷移的影響并試探討其機制。方法:H2228細胞瞬時轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis,mi R-200c mimicis negative control(NC),mi R-200c inhibitor及mi R-200c inhibitor NC;MTT法分別檢測克唑替尼對H2228細胞及轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis、mi R-200c inhibitor H2228細胞增殖情況的影響;Transwell法檢測H2228細胞及轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis、mi R-200c inhibitor H2228細胞遷移情況;生物信息學(xué)網(wǎng)站及軟件查詢預(yù)測mi R-200c作用靶基因,雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證ZEB1為mi R-200c的靶基因;實時定量PCR方法檢測H2228細胞及轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin及CD24的m RNA表達水平的變化;Western-blot技術(shù)檢測H2228細胞及轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的蛋白表達水平的變化。結(jié)果:1 H2228肺癌細胞轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis及陰性對照mimicis NC,轉(zhuǎn)染mi R-200c inhibitor及陰性對照inhibitor NC后檢測轉(zhuǎn)染效果為檢測mi R-200c對H2228細胞的影響,對該細胞進行mi R-200c mimicis,mi R-200c mimicis negative control(NC),mi R-200c inhibitor及mi R-200c inhibitor NC的轉(zhuǎn)染,我們發(fā)現(xiàn)H2228細胞轉(zhuǎn)染24小時后應(yīng)用RT-PCR方法檢測mi R-200c的表達結(jié)果:mi R200c表達水平明顯增高,較陰性對照增高310倍,兩者差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);相反,轉(zhuǎn)染mi R-200c inhibitor及陰性對照inhibitor NC后,mi R-200c表達水平則明顯降低,較陰性對照降低3.5倍,兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2 micro RNA-200c增加H2228細胞對克唑替尼的敏感性分別用濃度為50n M、100n M及200n M的克唑替尼處理轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis及陰性對照mimicis NC的H2228細胞后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后的細胞在以上各種濃度下,克唑替尼的抑制作用明顯增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同樣,細胞轉(zhuǎn)染mi R-200c inhibitor,抑制細胞mi R-200c表達后,克唑替尼在以上各種濃度下,對細胞的抑制作用較轉(zhuǎn)染陰性對照組明顯減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05及P0.01)。3 micro RNA-200c抑制H2228細胞遷移能力我們同時應(yīng)用Transwell小室檢測轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis及陰性對照mimicis NC,轉(zhuǎn)染mi R-200c inhibitor及陰性對照inhibitor NC的H2228細胞,我們發(fā)現(xiàn)增強細胞mi R-200c的表達后,細胞遷移能力明顯受到抑制(P0.01),相反,抑制mi R-200c表達后,細胞遷移能力增強(P0.05)。4雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證ZEB1為mi R-200c的靶基因。雙熒光素酶報告基因分析結(jié)果所示,Negative Control mi RNA轉(zhuǎn)染組(陰性對照組)、mi R-200c mimic轉(zhuǎn)染組ZEB1的相對熒光強度顯示,mi R-200c mimics轉(zhuǎn)染組能夠降低ZEB1相對熒光強度(P0.05)5 mi R-200c對H2228細胞EMT標志物表達的影響通過q RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis及陰性對照mimicis NC的H2228細胞,其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的m RNA表達水平的不同。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis的H2228細胞,其N-cadherin,Vimentin,CD24的m RNA表達水平較陰性對照組明顯減低(P0.05及P0.01),而E-cadherin的m RNA表達水平較陰性對照組明顯增高(P0.01)。相應(yīng)的,應(yīng)用western blot分析方法檢測轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis及陰性對照mimicis NC的H2228細胞,其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的蛋白表達水平的不同,發(fā)現(xiàn)與m RNA表示差異相似,轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis的H2228細胞,其N-cadherin,Vimentin,CD24的蛋白表達水平較陰性對照組明顯減低(P0.05),而E-cadherin的蛋白表達水平較陰性對照組明顯增高(P0.01)。結(jié)論:mi R-200c過表達可以通過調(diào)節(jié)ZEB1,使靶細胞發(fā)生EMT改變,可以增加ALK陽性肺癌細胞H2228對克唑替尼的敏感性并可以抑制H2228細胞的遷移性。第三部分:耐克唑替尼ALK陽性肺癌細胞株H2228/CR的培養(yǎng)及特點目的:通過對耐克唑替尼ALK陽性肺癌細胞株H2228/CR的培養(yǎng),進一步了解耐藥細胞發(fā)生的變化并探討耐藥發(fā)生的機制。方法:體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法,建立H2228細胞對克唑替尼的耐藥細胞株H2228/CR;觀察ALK陽性肺癌細胞株H2228和其耐藥細胞株H2228/CR的形態(tài)學(xué)變化;MTT法檢測鑒定克唑替尼對H2228及其耐藥細胞株H2228/CR增殖活性的影響,計算H2228/CR細胞的IC50及耐藥倍數(shù):Transwell法分別檢測H2228及H2228/CR細胞的遷移率;RT-PCR方法檢測H2228及H222/8CR細胞N-cadherin,Vimentin,E-cadherin、ZEB1及ZEB2的m RNA表達差異;Western blot實驗方法檢測H2228及H2228/CR細胞N-cadherin,Vimentin,E-cadherin、ZEB1及ZEB2的蛋白表達差異。結(jié)果:1耐克唑替尼細胞系H2228/CR對克唑替尼明顯耐藥經(jīng)過6個月余的培養(yǎng),我們最終獲得了耐藥細胞H2228/CR,該細胞可以在800n M濃度的克唑替尼藥物中生長。低倍鏡下觀察H2228細胞及H2228/CR細胞,發(fā)現(xiàn)耐藥細胞形態(tài)學(xué)上明顯發(fā)生了變化,由橢圓形變?yōu)榧忓N形,細胞排列較松散。MTT法測定細胞生存率發(fā)現(xiàn),克唑替尼對H2228/CR細胞的抑制作用明顯減弱,對親代H2228細胞的IC50為121.9n M對H2228/CR細胞的IC50為2618.45n M,耐藥增加了21.5倍。2耐藥細胞H2228/CR有著更高的侵襲力應(yīng)用Transwell法檢測H2228細胞及H2228/CR細胞的遷移率,我們發(fā)現(xiàn),細胞的遷移率較親代細胞H2228明顯增高(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3 H2228/CR細胞發(fā)生EMT改變?nèi)缟纤?H2228/CR細胞由橢圓形向紡錘形改變,排列較分散,提示可能存在間質(zhì)改變。用RT-PCR和western blot實驗進一步檢測H2228CR細胞中EMT標志物的改變,檢測H2228/CR細胞的分在標記物后發(fā)現(xiàn)其E-cadherin無論在m RNA水平還是在蛋白水平表達均較親代H2228細胞明顯減低,而N-cadherin,Vimentin,則在m RNA及蛋白水平均增高。結(jié)論:1耐克唑替尼藥物的ALK陽性肺癌細胞H2228/CR細胞培養(yǎng)成功,耐藥倍數(shù)為21.5倍,達到進一步實驗要求。2耐藥細胞株H2228/CR較原始非耐藥細胞有著更明顯的侵襲性且發(fā)生了EMT改變。第四部分mi R-200c通過靶向調(diào)節(jié)ZEB1逆轉(zhuǎn)EMT增加耐克唑替尼H2228/CR細胞對克唑替尼的敏感性目的:耐克唑替尼細胞株H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c,研究轉(zhuǎn)染后細胞遷移性及對克唑替尼藥物敏感性變化并探討機制。方法:RT-PCR方法檢測H2228細胞及H2228/CR細胞mi R-200c的表達;H2228/CR細胞瞬時轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis,mi R-200c mimicis negative control;MTT法分別檢測克唑替尼對H2228細胞及H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis、mi R-200c mimicis NC后細胞增殖抑制情況;Transwell法檢測H2228細胞及H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis、mi R-200c mimicis NC后細胞遷移情況;實時定量PCR方法檢測H2228細胞及H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin及CD24的m RNA表達水平的變化;Western-blot方法檢測H2228細胞及轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的蛋白表達水平的變化。結(jié)果:1 mi R-200c在耐藥細胞H2228/CR中表達較H2228細胞明顯降低應(yīng)用RT-PCR方法同時檢測H2228細胞及H2228/CR細胞的mi RNA-200c的表達發(fā)現(xiàn),與親代細胞H2228比較,耐藥細胞H2228/CR的mi R-200c減低23.4倍。2恢復(fù)表達mi R-200c后,H2228/CR細胞對克唑替尼敏感性增加H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis及陰性對照mimics-NC,RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效果顯示,H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis后其mi R-200c表達較H2228及H2228/CR陰性轉(zhuǎn)染明顯增高。MTT方法檢測克唑替尼對以上3種細胞的抑制情況發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis的H2228/CR細胞的增殖受克唑替尼的抑制較轉(zhuǎn)染了陰性對照mimicis NC組的細胞明顯增強,但未恢復(fù)到克唑替尼對親代H2228細胞即耐藥前的抑制水平。3恢復(fù)表達mi R-200c后,H2228/CR細胞的遷移降低Transwell方法檢測H2228細胞及H2228/CR轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis、mi R-200c mimicis NC后細胞遷移情況發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis的H2228/CR細胞的遷移性較轉(zhuǎn)染了陰性對照mimicis NC組的細胞明顯減低,但仍高于親代H2228細胞的遷移率。4 mi R-200c逆轉(zhuǎn)H2228/CR細胞發(fā)生的EMT改變用RT-PCR實驗進一步檢測H2228細胞及轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis和轉(zhuǎn)染mi R-200c mimicis NC后H2228/CR細胞中N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的m RNA變化,我們發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis的H2228/CR細胞其E-cadherin的m RNA表達較陰性對照增高(P0.05),較親代H2228細胞減低更明顯(P0.01),而N-cadherin,Vimentin和CD24的m RNA表達較陰性對照明顯減低(P0.01),較親代H2228細胞增高(P0.05)。同樣,與m RNA表達相對應(yīng),應(yīng)用Western-blot方法檢測以上3中細胞相應(yīng)蛋白表達發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了mi R-200c mimicis的H2228/CR細胞其E-cadherin的蛋白表達較陰性對照增高(P0.05),但較親代H2228細胞減低(P0.01),而N-cadherin,Vimentin和CD24的蛋白表達表達較陰性對照明顯增高(P0.05),較親代H2228細胞增高更明顯(P0.01)。結(jié)論:1耐克唑替尼細胞H2228/CR其mi R-200c表達較親代明顯減低,恢復(fù)表達mi R-200c后,H2228/CR細胞對克唑替尼的敏感性增加,遷移率減低。2通過檢測相關(guān)m RNA及蛋白表達水平發(fā)現(xiàn),mi R-200c是通過逆轉(zhuǎn)EMT過程而增加H2228/CR對克唑替尼的敏感性
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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1 胡麗麗;尹燕軍;鐘文娟;邱峰;;miR-200c增強肺癌A549細胞對紫杉醇及吉非替尼的敏感度及相關(guān)機制[J];腫瘤防治研究;2015年08期

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本文編號：1843070