發(fā)布時(shí)間：2018-05-04 00:16

  本文選題：rApoptin + MCF-7人乳腺癌細(xì)胞　； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：乳腺癌是女性群體最常罹患的惡性腫瘤,無論發(fā)病率還是致死率都位居環(huán)球婦女惡性腫瘤的第1位,且相應(yīng)統(tǒng)計(jì)數(shù)字仍在持續(xù)上升。與增長(zhǎng)迅猛的乳腺癌發(fā)病率相比,乳腺癌的治療目前仍是世界性難題。因此,研發(fā)更有效的的抗腫瘤制劑,不僅具有極大的社會(huì)效益,還會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。Apoptin是雞貧血病毒(Chicken anemia virus,CAV)唯一的功能性蛋白。與現(xiàn)有的抗腫瘤制劑相比,Apoptin具備以下幾個(gè)特性:其一,Apoptin并不依靠P53途徑促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,可有效治療那些P53基因發(fā)生突變的腫瘤;其二,Bcl-2的過表達(dá)并不能抑制Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng),反而可被利用來增強(qiáng)其作用;其三,Apoptin具備選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。目前,若將Apoptin投入規(guī)模化生產(chǎn)和廣泛臨床應(yīng)用,存在兩個(gè)重要的技術(shù)瓶頸:其一,人體細(xì)胞膜表面沒有Apoptin蛋白相關(guān)的受體,其不能與人的細(xì)胞結(jié)合、發(fā)揮效應(yīng);其二,原核表達(dá)的Apoptin蛋白在體外難以溶解、不能穩(wěn)定保存,很難獲得大量高純度的制劑。為尋找并驗(yàn)證更好的應(yīng)用Apoptin的技術(shù)手段,本課題組應(yīng)用重組腫瘤特異性凋亡因子(r Apoptin),研究其對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞及其干細(xì)胞在體內(nèi)外的殺傷作用及機(jī)制。r Apoptin系GST-Apoptin經(jīng)葉酸化學(xué)修飾而成的重組蛋白。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體數(shù)量是正常細(xì)胞的幾十倍之多,這意味著葉酸修飾的r Apoptin蛋白可明顯富集于腫瘤細(xì)胞、發(fā)揮殺傷作用。目前,尚無關(guān)于r Apoptin是否可有效抑制乳腺癌、乳腺癌干細(xì)胞及其相關(guān)作用機(jī)制的文獻(xiàn)報(bào)道。因此,研究r Apoptin的殺傷效能及其相關(guān)作用機(jī)制,極有可能為提升乳腺癌臨床療效及預(yù)后結(jié)果帶來新的希望。相關(guān)因子的磷酸化是Apoptin誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中重要的作用機(jī)制。Akt是其信號(hào)通路上游的核心因子,Apoptin進(jìn)入胞漿后可磷酸化Akt并與之結(jié)合、將其“劫持”到胞核內(nèi),發(fā)揮誘發(fā)凋亡的作用。相對(duì)應(yīng)的,Nur77的磷酸化則是信號(hào)通路下游的核心事件,Nur77被Apoptin磷酸化后從細(xì)胞核易位至胞漿,啟動(dòng)線粒體凋亡通路、推動(dòng)凋亡進(jìn)展。Caspase-3則是Apoptin信號(hào)通路的最終執(zhí)行子,其通過被剪切活化來最終實(shí)現(xiàn)凋亡效應(yīng)。本研究首先以MCF-7人乳腺癌細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象。通過CCK-8法檢測(cè)r Apoptin對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率曲線,確定后續(xù)藥物處理時(shí)間及濃度梯度;通過集落形成實(shí)驗(yàn),測(cè)試r Apoptin的抑增殖效應(yīng);通過AV/PI雙染法,測(cè)試其誘發(fā)凋亡的效能;通過Western Blot技術(shù),檢測(cè)加藥處理后,Apoptin信號(hào)通路中,磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化Nur77(p-Nur77)及Caspase-3 p17活化片段的水平變化。在此基礎(chǔ)上,我們建立了MCF-7細(xì)胞的裸鼠移植瘤模型,并以之為第二階段的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。荷瘤小鼠經(jīng)r Apoptin治療后,我們通過稱量瘤體重量、HE染色來研究移植瘤的形態(tài)變化;通過免疫組化染色、Western Blot試驗(yàn),觀察移植瘤組織中Apoptin信號(hào)通路的激活情況。最后,我們以MCF-7細(xì)胞中的乳腺癌干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。通過乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記CD44+/CD24-的流式細(xì)胞分析、無血清培養(yǎng)乳腺球形成實(shí)驗(yàn)及Western Blot、q RT-PCR技術(shù),檢測(cè)ALDH1的水平變化,以明確r Apoptin是否可有效抑制MCF-7細(xì)胞中的乳腺癌干細(xì)胞。第一部分r Apoptin對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的研究目的:探討r Apoptin是否可有效抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘發(fā)凋亡及其相關(guān)作用機(jī)制,為進(jìn)一步研究r Apoptin的體內(nèi)作用奠定基礎(chǔ)。方法:以CCK-8法檢測(cè)r Apoptin對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率曲線,以細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)試其抑增殖效應(yīng),Annexin V/PI雙染法檢測(cè)其誘發(fā)凋亡的效能,Western Blot檢測(cè)r Apoptin加藥處理對(duì)Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3活化水平的影響。結(jié)果:r Apoptin可抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其凋亡;其作用機(jī)制是經(jīng)由Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活來實(shí)現(xiàn)的。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:r Apoptin處理24h,其IC50為3.2μg/ml;當(dāng)藥物濃度為1.0μg/ml、2.0μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、5.0μg/ml、6.0μg/ml、7.0μg/ml時(shí),MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸升高,依次為6.67±1.10%、38.13±2.48%、45.09±3.60%、56.30±4.59%、68.79±6.08%、85.59±4.36%、92.34±1.00%、94.56±0.99%;除6.0μg/ml、7.0μg/ml組間外,其余各組間生長(zhǎng)抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P0.05)。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:加藥6天,當(dāng)藥物濃度為0μg/ml、0.6μg/ml、1.2μg/ml、1.8μg/ml、2.4μg/ml、3.0μg/ml時(shí),各組的克隆形成率逐漸降低,依次為93.67±1.86%、85.56±1.90%、42.56±6.08%、27.22±4.68%、14.56±3.86%、8.67±1.33%;各實(shí)驗(yàn)組的克隆形成率與對(duì)照組相比均有顯著差別(P0.01);除2.4μg/ml、3.0μg/ml組間外,其余各實(shí)驗(yàn)組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P0.05)。流式細(xì)胞Annexin V/PI雙染法顯示:加藥24h,0μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、4.8μg/ml組的早期細(xì)胞凋亡率逐漸升高,依次為1.36±0.14%、4.24±0.74%、4.69±0.60%、12.84±1.24%,1.6μg/ml、3.2μg/ml組間無顯著差別(P0.05),其余組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P0.05);同時(shí),各組晚期凋亡和壞死率依次為0.78±0.42%、2.00±0.52%、1.93±0.76%、2.30±0.79%,組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:加藥24h,MCF-7細(xì)胞中p-Akt、p-Nur77及Caspase-3 p17的水平隨藥物濃度增加而逐漸升高,組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p0.05)。結(jié)論:r Apoptin可抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,藥物濃度與凋亡效應(yīng)之間存在正向的劑量與效應(yīng)關(guān)系。r Apoptin可致Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活,其誘發(fā)凋亡的機(jī)制可能是通過Apoptin的凋亡誘導(dǎo)信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。除誘發(fā)凋亡的作用外,r Apoptin可能具備對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期抑制能力。第二部分r Apoptin對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用目的:探討r Apoptin是否能夠有效的抑制MCF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡及其相關(guān)作用機(jī)制。方法:通過在裸鼠乳腺墊內(nèi)注射MCF-7細(xì)胞種植移植瘤。使用r Apoptin治療后,通過測(cè)量瘤體重量、HE染色觀察移植瘤的形態(tài)變化;通過免疫組織化學(xué)染色、Western Blot技術(shù)檢測(cè)移植瘤組織中p-Akt、p-Nur77及Caspase-3 p17活化片段的水平變化。結(jié)果:r Apoptin可抑制MCF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)、誘發(fā)凋亡;其作用機(jī)制是經(jīng)由Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活來實(shí)現(xiàn)的。移植瘤測(cè)量結(jié)果顯示:經(jīng)r Apoptin注射,0mg/kg、0.8mg/kg、1.6 mg/kg組腫瘤的重量逐漸降低,依次為2.50±0.27g、1.92±0.60g、1.18±0.29g,各組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p0.05)。HE染色結(jié)果顯示:加藥組多見片灶狀組織結(jié)構(gòu)缺失,多數(shù)細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞核固縮深染,未見明顯炎癥反應(yīng)。免疫組化染色結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞中,p-Akt、p-Nur77和Caspase-3 p17均被染成棕黃色、定位于胞漿中,隨藥物濃度增加、其含量逐漸升高。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:加藥24h,移植瘤組織中p-Akt、p-Nur77及Caspase-3 p17的水平隨藥物濃度增加而逐漸升高,組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p0.05);Western Blot的檢測(cè)結(jié)果與免疫組化染色結(jié)果基本一致。結(jié)論:r Apoptin可抑制MCF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其凋亡,藥物濃度與凋亡效應(yīng)之間存在正向的劑量與效應(yīng)關(guān)系。r Apoptin誘發(fā)凋亡的作用機(jī)制是通過Apoptin凋亡信號(hào)通路,經(jīng)由Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活來實(shí)現(xiàn)的。r Apoptin可有效穿過MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞膜及核膜,且葉酸修飾并不影響其Apoptin部分的誘發(fā)凋亡能力。r Apoptin對(duì)荷瘤的裸鼠無明顯毒副作用。第三部分r Apoptin對(duì)MCF-7細(xì)胞中的乳腺癌干細(xì)胞抑制能力的研究目的:探討r Apoptin是否能夠有效的抑制MCF-7細(xì)胞中的乳腺癌干細(xì)胞方法:通過CD44+/CD24-流式細(xì)胞比例分析、無血清培養(yǎng)乳腺球形成實(shí)驗(yàn)及Western Blot、q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ALDH1的水平,來檢驗(yàn)r Apoptin是否可對(duì)MCF-7細(xì)胞中的乳腺癌干細(xì)胞產(chǎn)生有效抑制。結(jié)果:r Apoptin對(duì)MCF-7細(xì)胞中的乳腺癌干細(xì)胞無顯著抑制作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:加藥24h,0μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、4.8μg/ml組CD44+/CD24-細(xì)胞的比例逐漸升高,依次為2.10±0.16%、7.61±1.11%、10.38±0.97%、13.21±1.90%,各組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p0.05)。乳腺球形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:加藥處理14d,0μg/ml、1.2μg/ml、2.4μg/ml組形成的乳腺球均細(xì)胞連接緊密、體積大小無顯著差別,其數(shù)量依次為116.33±5.03、122.33±4.93、124.67±6.03,各組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p0.05)。Western Blot及q RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:加藥24h,ALDH1的蛋白及m RNA水平隨藥物濃度增加而逐漸升高,組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p0.05)。結(jié)論:r Apoptin不能有效抑制MCF-7細(xì)胞中的乳腺癌干細(xì)胞,其可能被乳腺癌干細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制所抵抗。
[Abstract]:Apoptin is the only functional protein to induce apoptosis of breast cancer , breast cancer stem cells and its related mechanisms . The effect of r Apoptin on the growth inhibition rate of MCF - 7 cells was investigated by means of CCK - 8 method . The inhibition rate of growth inhibition of MCF - 7 cells increased gradually from 6.67 鹵 1.10 % , 38.13 鹵 2.48 % , 45.09 鹵 3.60 % , 56.30 鹵 4.59 % , 4.09 鹵 3.60 % , 56.30 鹵 4.59 % , 8.79 鹵 6.08 % , 5.59 鹵 4.36 % , 92.34 鹵 1.00 % , 94.56 鹵 0.99 % , respectively . The results showed that r Apoptin could inhibit the growth of MCF - 7 cells and induce apoptosis . The results showed that r Apoptin could inhibit the growth and apoptosis of tumor cells in MCF - 7 cells . The results showed that r Apoptin could inhibit the growth of tumor cells in MCF - 7 cells and induce apoptosis . The results showed that r Apoptin could inhibit the proliferation of breast cancer stem cells in MCF - 7 cells . The results showed that r Apoptin could inhibit the proliferation of breast cancer stem cells in MCF - 7 cells . The results showed that r Apoptin could not inhibit the proliferation of breast cancer stem cells in MCF - 7 cells .

【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉福英,王秀芳,馮旭;可移植性腫瘤動(dòng)物模型的復(fù)制應(yīng)用及問題[J];醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制;2000年09期

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本文編號(hào)：1840728