本文選題：rApoptin + MCF-7人乳腺癌細胞��； 參考：《大連醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：乳腺癌是女性群體最常罹患的惡性腫瘤,無論發(fā)病率還是致死率都位居環(huán)球婦女惡性腫瘤的第1位,且相應統(tǒng)計數字仍在持續(xù)上升。與增長迅猛的乳腺癌發(fā)病率相比,乳腺癌的治療目前仍是世界性難題。因此,研發(fā)更有效的的抗腫瘤制劑,不僅具有極大的社會效益,還會產生巨大的經濟效益。Apoptin是雞貧血病毒(Chicken anemia virus,CAV)唯一的功能性蛋白。與現有的抗腫瘤制劑相比,Apoptin具備以下幾個特性:其一,Apoptin并不依靠P53途徑促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡,可有效治療那些P53基因發(fā)生突變的腫瘤;其二,Bcl-2的過表達并不能抑制Apoptin誘導腫瘤細胞凋亡的效應,反而可被利用來增強其作用;其三,Apoptin具備選擇性的誘導腫瘤細胞凋亡的能力。目前,若將Apoptin投入規(guī)�；a和廣泛臨床應用,存在兩個重要的技術瓶頸:其一,人體細胞膜表面沒有Apoptin蛋白相關的受體,其不能與人的細胞結合、發(fā)揮效應;其二,原核表達的Apoptin蛋白在體外難以溶解、不能穩(wěn)定保存,很難獲得大量高純度的制劑。為尋找并驗證更好的應用Apoptin的技術手段,本課題組應用重組腫瘤特異性凋亡因子(r Apoptin),研究其對MCF-7人乳腺癌細胞及其干細胞在體內外的殺傷作用及機制。r Apoptin系GST-Apoptin經葉酸化學修飾而成的重組蛋白。研究發(fā)現,腫瘤細胞表面的葉酸受體數量是正常細胞的幾十倍之多,這意味著葉酸修飾的r Apoptin蛋白可明顯富集于腫瘤細胞、發(fā)揮殺傷作用。目前,尚無關于r Apoptin是否可有效抑制乳腺癌、乳腺癌干細胞及其相關作用機制的文獻報道。因此,研究r Apoptin的殺傷效能及其相關作用機制,極有可能為提升乳腺癌臨床療效及預后結果帶來新的希望。相關因子的磷酸化是Apoptin誘導細胞凋亡過程中重要的作用機制。Akt是其信號通路上游的核心因子,Apoptin進入胞漿后可磷酸化Akt并與之結合、將其“劫持”到胞核內,發(fā)揮誘發(fā)凋亡的作用。相對應的,Nur77的磷酸化則是信號通路下游的核心事件,Nur77被Apoptin磷酸化后從細胞核易位至胞漿,啟動線粒體凋亡通路、推動凋亡進展。Caspase-3則是Apoptin信號通路的最終執(zhí)行子,其通過被剪切活化來最終實現凋亡效應。本研究首先以MCF-7人乳腺癌細胞為試驗對象。通過CCK-8法檢測r Apoptin對MCF-7細胞的抑制率曲線,確定后續(xù)藥物處理時間及濃度梯度;通過集落形成實驗,測試r Apoptin的抑增殖效應;通過AV/PI雙染法,測試其誘發(fā)凋亡的效能;通過Western Blot技術,檢測加藥處理后,Apoptin信號通路中,磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化Nur77(p-Nur77)及Caspase-3 p17活化片段的水平變化。在此基礎上,我們建立了MCF-7細胞的裸鼠移植瘤模型,并以之為第二階段的實驗對象。荷瘤小鼠經r Apoptin治療后,我們通過稱量瘤體重量、HE染色來研究移植瘤的形態(tài)變化;通過免疫組化染色、Western Blot試驗,觀察移植瘤組織中Apoptin信號通路的激活情況。最后,我們以MCF-7細胞中的乳腺癌干細胞為實驗對象。通過乳腺癌干細胞標記CD44+/CD24-的流式細胞分析、無血清培養(yǎng)乳腺球形成實驗及Western Blot、q RT-PCR技術,檢測ALDH1的水平變化,以明確r Apoptin是否可有效抑制MCF-7細胞中的乳腺癌干細胞。第一部分r Apoptin對MCF-7人乳腺癌細胞生長抑制作用的研究目的:探討r Apoptin是否可有效抑制MCF-7細胞的生長、誘發(fā)凋亡及其相關作用機制,為進一步研究r Apoptin的體內作用奠定基礎。方法:以CCK-8法檢測r Apoptin對MCF-7細胞的生長抑制率曲線,以細胞集落形成實驗測試其抑增殖效應,Annexin V/PI雙染法檢測其誘發(fā)凋亡的效能,Western Blot檢測r Apoptin加藥處理對Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3活化水平的影響。結果:r Apoptin可抑制MCF-7細胞的生長、誘導其凋亡;其作用機制是經由Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活來實現的。CCK-8實驗結果顯示:r Apoptin處理24h,其IC50為3.2μg/ml;當藥物濃度為1.0μg/ml、2.0μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、5.0μg/ml、6.0μg/ml、7.0μg/ml時,MCF-7細胞的生長抑制率逐漸升高,依次為6.67±1.10%、38.13±2.48%、45.09±3.60%、56.30±4.59%、68.79±6.08%、85.59±4.36%、92.34±1.00%、94.56±0.99%;除6.0μg/ml、7.0μg/ml組間外,其余各組間生長抑制率均有統(tǒng)計學差別(P0.05)。集落形成實驗結果顯示:加藥6天,當藥物濃度為0μg/ml、0.6μg/ml、1.2μg/ml、1.8μg/ml、2.4μg/ml、3.0μg/ml時,各組的克隆形成率逐漸降低,依次為93.67±1.86%、85.56±1.90%、42.56±6.08%、27.22±4.68%、14.56±3.86%、8.67±1.33%;各實驗組的克隆形成率與對照組相比均有顯著差別(P0.01);除2.4μg/ml、3.0μg/ml組間外,其余各實驗組間均有統(tǒng)計學差別(P0.05)。流式細胞Annexin V/PI雙染法顯示:加藥24h,0μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、4.8μg/ml組的早期細胞凋亡率逐漸升高,依次為1.36±0.14%、4.24±0.74%、4.69±0.60%、12.84±1.24%,1.6μg/ml、3.2μg/ml組間無顯著差別(P0.05),其余組間有統(tǒng)計學差別(P0.05);同時,各組晚期凋亡和壞死率依次為0.78±0.42%、2.00±0.52%、1.93±0.76%、2.30±0.79%,組間無統(tǒng)計學差別(P0.05)。Western Blot檢測結果顯示:加藥24h,MCF-7細胞中p-Akt、p-Nur77及Caspase-3 p17的水平隨藥物濃度增加而逐漸升高,組間比較有統(tǒng)計學差別(p0.05)。結論:r Apoptin可抑制MCF-7細胞的生長、誘導其發(fā)生凋亡,藥物濃度與凋亡效應之間存在正向的劑量與效應關系。r Apoptin可致Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活,其誘發(fā)凋亡的機制可能是通過Apoptin的凋亡誘導信號通路來實現的。除誘發(fā)凋亡的作用外,r Apoptin可能具備對MCF-7細胞的細胞周期抑制能力。第二部分r Apoptin對MCF-7人乳腺癌細胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用目的:探討r Apoptin是否能夠有效的抑制MCF-7細胞裸鼠移植瘤生長、誘導凋亡及其相關作用機制。方法:通過在裸鼠乳腺墊內注射MCF-7細胞種植移植瘤。使用r Apoptin治療后,通過測量瘤體重量、HE染色觀察移植瘤的形態(tài)變化;通過免疫組織化學染色、Western Blot技術檢測移植瘤組織中p-Akt、p-Nur77及Caspase-3 p17活化片段的水平變化。結果:r Apoptin可抑制MCF-7細胞裸鼠移植瘤的生長、誘發(fā)凋亡;其作用機制是經由Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活來實現的。移植瘤測量結果顯示:經r Apoptin注射,0mg/kg、0.8mg/kg、1.6 mg/kg組腫瘤的重量逐漸降低,依次為2.50±0.27g、1.92±0.60g、1.18±0.29g,各組間均具有統(tǒng)計學差別(p0.05)。HE染色結果顯示:加藥組多見片灶狀組織結構缺失,多數細胞體積縮小,細胞核固縮深染,未見明顯炎癥反應。免疫組化染色結果顯示:各實驗組腫瘤細胞中,p-Akt、p-Nur77和Caspase-3 p17均被染成棕黃色、定位于胞漿中,隨藥物濃度增加、其含量逐漸升高。Western Blot檢測結果顯示:加藥24h,移植瘤組織中p-Akt、p-Nur77及Caspase-3 p17的水平隨藥物濃度增加而逐漸升高,組間比較具有統(tǒng)計學差別(p0.05);Western Blot的檢測結果與免疫組化染色結果基本一致。結論:r Apoptin可抑制MCF-7細胞裸鼠移植瘤的生長、誘導其凋亡,藥物濃度與凋亡效應之間存在正向的劑量與效應關系。r Apoptin誘發(fā)凋亡的作用機制是通過Apoptin凋亡信號通路,經由Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活來實現的。r Apoptin可有效穿過MCF-7細胞的細胞膜及核膜,且葉酸修飾并不影響其Apoptin部分的誘發(fā)凋亡能力。r Apoptin對荷瘤的裸鼠無明顯毒副作用。第三部分r Apoptin對MCF-7細胞中的乳腺癌干細胞抑制能力的研究目的:探討r Apoptin是否能夠有效的抑制MCF-7細胞中的乳腺癌干細胞方法:通過CD44+/CD24-流式細胞比例分析、無血清培養(yǎng)乳腺球形成實驗及Western Blot、q RT-PCR技術檢測ALDH1的水平,來檢驗r Apoptin是否可對MCF-7細胞中的乳腺癌干細胞產生有效抑制。結果:r Apoptin對MCF-7細胞中的乳腺癌干細胞無顯著抑制作用。流式細胞儀檢測結果顯示:加藥24h,0μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、4.8μg/ml組CD44+/CD24-細胞的比例逐漸升高,依次為2.10±0.16%、7.61±1.11%、10.38±0.97%、13.21±1.90%,各組間均具有統(tǒng)計學差別(p0.05)。乳腺球形成實驗結果顯示:加藥處理14d,0μg/ml、1.2μg/ml、2.4μg/ml組形成的乳腺球均細胞連接緊密、體積大小無顯著差別,其數量依次為116.33±5.03、122.33±4.93、124.67±6.03,各組間均無統(tǒng)計學差別(p0.05)。Western Blot及q RT-PCR檢測結果顯示:加藥24h,ALDH1的蛋白及m RNA水平隨藥物濃度增加而逐漸升高,組間比較有統(tǒng)計學差別(p0.05)。結論:r Apoptin不能有效抑制MCF-7細胞中的乳腺癌干細胞,其可能被乳腺癌干細胞的多藥耐藥機制所抵抗。
[Abstract]:Apoptin is the only functional protein to induce apoptosis of breast cancer , breast cancer stem cells and its related mechanisms . The effect of r Apoptin on the growth inhibition rate of MCF - 7 cells was investigated by means of CCK - 8 method . The inhibition rate of growth inhibition of MCF - 7 cells increased gradually from 6.67 鹵 1.10 % , 38.13 鹵 2.48 % , 45.09 鹵 3.60 % , 56.30 鹵 4.59 % , 4.09 鹵 3.60 % , 56.30 鹵 4.59 % , 8.79 鹵 6.08 % , 5.59 鹵 4.36 % , 92.34 鹵 1.00 % , 94.56 鹵 0.99 % , respectively . The results showed that r Apoptin could inhibit the growth of MCF - 7 cells and induce apoptosis . The results showed that r Apoptin could inhibit the growth and apoptosis of tumor cells in MCF - 7 cells . The results showed that r Apoptin could inhibit the growth of tumor cells in MCF - 7 cells and induce apoptosis . The results showed that r Apoptin could inhibit the proliferation of breast cancer stem cells in MCF - 7 cells . The results showed that r Apoptin could inhibit the proliferation of breast cancer stem cells in MCF - 7 cells . The results showed that r Apoptin could not inhibit the proliferation of breast cancer stem cells in MCF - 7 cells .

【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 劉福英,王秀芳,馮旭;可移植性腫瘤動物模型的復制應用及問題[J];醫(yī)學動物防制;2000年09期

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本文編號：1840728