本文選題：TAK1 + 紫杉醇��； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景卵巢上皮性惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌,位于婦科惡性腫瘤的第三位,全球每年新診斷病例約24萬人,死亡病例約15萬人。雖然近年來由于TC(紫杉醇、卡鉑)、TP(紫杉醇、順鉑)、DC(多西他賽、卡鉑)等有效化療方案的應(yīng)用,使得卵巢癌的治療效果有了明顯提高,但是其5年生存率也僅僅在25%-30%之間�，F(xiàn)在對(duì)于復(fù)發(fā)性卵巢癌缺乏有效的治療手段,因此目前對(duì)于卵巢上皮性癌的治療效果一直未能與卵巢惡性生殖細(xì)胞腫瘤那樣出現(xiàn)質(zhì)的飛躍,導(dǎo)致卵巢惡性腫瘤致死率居?jì)D科惡性腫瘤的首位。卵巢癌的高死亡率主要是歸功于腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)對(duì)細(xì)胞毒類的化療藥物抵抗和一些細(xì)胞克隆發(fā)展成復(fù)發(fā)腫瘤,因此對(duì)化療藥物耐藥是卵巢癌治療過程中常見并且是富有挑戰(zhàn)性的問題。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1(TAK1或稱MAP3K7)是細(xì)胞內(nèi)的分子中心,于1995年經(jīng)對(duì)c DNA文庫篩選和蛋白碎片互補(bǔ)分析時(shí)在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β通路中被發(fā)現(xiàn),它調(diào)控著NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶MAPK信號(hào)通路,在細(xì)胞生存,免疫應(yīng)答,新陳代謝和致癌中起到關(guān)鍵作用,其主要通過TAK1-NF-κB途徑抑制凋亡蛋白酶的激活從而阻止了凋亡細(xì)胞的死亡導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生無限增殖,引起腫瘤的發(fā)生。最近的研究表明TAK1在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)。由此可見TAK1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用。然而關(guān)于TAK1在卵巢癌中的表達(dá)情況以及TAK1在卵巢癌中的發(fā)生、發(fā)展中作用特別是對(duì)于耐受紫杉醇的卵巢癌中的作用,國內(nèi)外相關(guān)的報(bào)道較少�；诖朔N情況,本研究的目的是對(duì)TAK1在卵巢癌組織和接受紫杉醇治療復(fù)發(fā)卵巢癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),并通過RNAi技術(shù)和TAK1的特異抑制劑5Z-7-oxozeaenol抑制卵巢癌SKOV3和OVCAR3細(xì)胞系中的TAK1的表達(dá),建立耐受醇的SKOV3PR細(xì)胞系,觀察TAK1的表達(dá)情況及其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響;建立雌性裸鼠的移植瘤模型,觀察抑制了TAK1后移植瘤對(duì)紫杉醇治療的反應(yīng),探討TAK1在卵巢癌中的預(yù)后價(jià)值及TAK1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用,試圖建立抑制TAK1在紫杉醇治療卵巢癌中的潛在的抗腫瘤潛能,并期待這些實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)能夠改變卵巢癌患者的臨床治療效果。第一部分 TAK1蛋白在卵巢組織及卵巢癌細(xì)胞中的差異表達(dá)及其臨床意義目的:觀察TAK1在卵巢癌組織及其復(fù)發(fā)組織中的表達(dá)情況,探討TAK1的表達(dá)與卵巢癌的臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系,同時(shí)觀察TAK1在SKOV3細(xì)胞和耐受紫杉醇的SKOV3PR細(xì)胞之間的表達(dá)特征。方法:采用western-blotting方法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及耐受紫杉醇的SKOV3PR細(xì)胞系中的TAK1及p-TAK1蛋白的表達(dá)及Q-PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞中TAK1m RNA的表達(dá)情況,采用免疫組織化學(xué)半定量法檢測(cè)了原發(fā)卵巢癌組織和復(fù)發(fā)卵巢癌組織中的TAK1及p-TAK1的表達(dá)情況并隨訪患者的生存情況。結(jié)果:免疫組化結(jié)果分析顯示在復(fù)發(fā)組織中,TAK1的表達(dá)水平要高于原發(fā)組織(p=0.0076),與之相應(yīng)的,p-TAK1的活性在復(fù)發(fā)組織中的活性要高于原發(fā)腫瘤組織(p=0.021);TAK1的表達(dá)與患者FIGO分期、p53蛋白表達(dá)及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性,但是生存分析曲線顯示高表達(dá)的TAK1與較差的整體生存期(OS)顯著相關(guān)(p=0.031);TAK1m RNA在SKOVPR細(xì)胞中的表達(dá)要顯著高于SKOV3細(xì)胞(P=0.014);western blot結(jié)果顯示TAK1及p-TAK1蛋白在SKOV3的表達(dá)要顯著低于SKOV3PR細(xì)胞系中的表達(dá)(p=0.008與0.009)。結(jié)論:TAK1參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程,對(duì)紫杉醇產(chǎn)生耐受的卵巢癌細(xì)胞表現(xiàn)出TAK1及p-TAK1的過表達(dá),TAK1可能是卵巢癌的不良預(yù)后分子標(biāo)記物。第二部分 抑制TAK1的表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3及OVCAR3及耐紫杉醇的SKOV3PR細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響目的:通過si RNA和5Z-7-oxozeaenol抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞SKOV3PR細(xì)胞和OVCAR3細(xì)胞中的TAK1的表達(dá),分析沉默了TAK1的表達(dá)對(duì)不同卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲能力的影響,觀察TAK1沉默后紫杉醇對(duì)不同卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。方法:使用兩個(gè)獨(dú)立的TAK1靶向si RNAs(signal Silence（？）siRNAⅠ#6317和Ⅱ#6318)轉(zhuǎn)染SKOV3和OVCAR3細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組siRNAs(signal Silence（？）control si RNA#6201),western blotting方法檢測(cè)不同卵R巢癌細(xì)胞中TAK1、p-TAK1蛋白的表達(dá)。使用CCK-8實(shí)驗(yàn)、Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記試驗(yàn)和流水細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染抑制TAK1后的腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性變化及經(jīng)過紫杉醇處理和5Z-7-oxozeaenol處理后的增殖、凋亡以及侵襲能力的變化。結(jié)果:沉默TAK1能夠顯著提高紫杉醇在SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中的敏感性,5Z-7-oxozeaenol對(duì)于抑制TAK1的磷酸化抑制呈劑量依賴,5Z-7-oxozeaenol增加紫杉醇的細(xì)胞毒性的能力隨著其濃度的增加而顯著增加,在SKOV3細(xì)胞系中如無5Z-7-oxozeaenol處理,紫杉醇的IC50為2.5而在SKOV3PR中,如無5Z-7-oxozeaenol處理,則其IC50值為236。PI染色的SKOV3細(xì)胞使用流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)紫杉醇能夠增加G2/M期細(xì)胞比例,而SKVO3RP細(xì)胞對(duì)此并無此種反應(yīng),而同時(shí)給予5Z-7-oxozeaenol處理后,此種現(xiàn)象會(huì)再現(xiàn)。凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)紫杉醇組引起的凋亡與對(duì)照組相比較細(xì)胞凋亡明顯上升(p=0.02)而紫杉醇+TAK1抑制劑5Z-7-oxozeaenol組和對(duì)照組、5Z-7-oxozeaenol組及單獨(dú)使用紫杉醇組相比較差異有顯著意義(p=0.001)。結(jié)論:沉默TAK1的表達(dá)能夠增強(qiáng)紫杉醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,5Z-7-oxozeaenol提高紫杉醇的細(xì)胞毒作用呈劑量依賴性,耐受紫杉醇的卵巢細(xì)胞對(duì)于聯(lián)合使用了TAK1抑制5Z-7-oxozeaenol和紫杉醇更為敏感;聯(lián)合使用紫杉醇和TAK1抑制劑5Z-7-oxozeaenol能夠誘導(dǎo)G2/M捕獲并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。第三部分 聯(lián)合使用TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol和紫杉醇對(duì)無胸腺小鼠種植瘤生長(zhǎng)的影響目的:通過TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol聯(lián)合紫杉醇處置卵巢移植瘤動(dòng)物模型,觀察其對(duì)裸鼠卵巢癌移植瘤生長(zhǎng)及裸鼠成長(zhǎng)的影響并評(píng)估其安全性。方法:60只無胸腺雌性小鼠隨機(jī)分成4組(對(duì)照組、紫杉醇組、5z-7-oxozeaenol組、紫杉醇聯(lián)合5z-7-oxozeaenol組),每組15只,給予皮下注射SKOV3細(xì)胞5*106個(gè)細(xì)胞/每注射;建立卵巢癌移植瘤動(dòng)物模型,待到皮下腫瘤可觸及時(shí)給予紫杉醇8mg/kg和5z-7-oxozeaenol6.5mg/kg處理四周期后,處死小鼠前2小時(shí)給予腹膜腔內(nèi)注射Brd U 150mg/kg,記錄小鼠體重變化,稱量小鼠脾臟重量及切除的腫瘤重量,腫瘤細(xì)胞懸浮呈單細(xì)胞由流式細(xì)胞儀記錄腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性染色腫瘤細(xì)胞數(shù),檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖。結(jié)果:紫杉醇聯(lián)合5z-7-oxozeaenol處理組的移植瘤質(zhì)量要顯著低于其他三組(p0.01),Brd U檢測(cè)腫瘤細(xì)胞百分比顯著降低(p0.01);5z-7-oxozeaenol處理的小鼠顯示了更低的p-TAK1/TAK1比例(p0.01);各組之間的小鼠體重及脾臟重量無顯著差異。結(jié)論:紫杉醇聯(lián)合TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol能夠有效的抑制卵巢癌移植瘤的生長(zhǎng),并且其有效劑量在小鼠模型中能高度耐受。
[Abstract]:In recent years , it has been found that TAK1 plays a key role in the development of ovarian cancer . The effects of TAK1 on the proliferation , apoptosis and invasion ability of SKOV3PR cells and OVCAR3 cells were investigated . Results : Paclitaxel combined with TAK1 inhibitor 5z - 7 - oxozeatin can effectively inhibit the growth of ovarian cancer transplanted tumor , and its effective dose can be highly tolerant in mouse model .

【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：1835269