本文選題：結(jié)腸癌 + 酸性微環(huán)境��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：癌癥正在成為人類的第一殺手。世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《世界癌癥報告,2014))中稱,2012年全球新發(fā)癌癥病例(1400萬)以及癌癥相關(guān)死亡病例(820萬)均明顯增加,結(jié)直腸癌在全球腫瘤相關(guān)死亡原因以及新發(fā)癌癥病例中均排第三位。僅2012年,全球就有69.4萬人死于結(jié)直腸癌。在我國,結(jié)直腸癌的發(fā)病率居于惡性腫瘤第三位,死亡率居于第五位,嚴(yán)重威脅著人類的生命。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展并非一個孤立的過程,而是受到各種因素的影響,腫瘤微環(huán)境是最重要的影響因素之一。間質(zhì)組織、細(xì)胞外基質(zhì)等圍繞在腫瘤細(xì)胞周圍的局部環(huán)境構(gòu)成腫瘤微環(huán)境。目前研究顯示,腫瘤細(xì)胞微環(huán)境具有乏氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、低pH、血管生成增多以及炎性細(xì)胞浸潤等特點。腫瘤酸性微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞外局部環(huán)境的pH值變低的現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞主要通過糖酵解獲取能量,即使在有氧條件下也如此,稱為"Warburg效應(yīng)”(the Warburg effect)。糖酵解的終產(chǎn)物為酸性物質(zhì)-乳酸。腫瘤細(xì)胞代謝旺盛,因此會產(chǎn)生大量的乳酸,為了維持細(xì)胞內(nèi)正常的pH,腫瘤細(xì)胞膜上的Na+/H+交換器和質(zhì)子泵等不斷的將細(xì)胞內(nèi)的H+運輸至細(xì)胞外,同時,由于腫瘤周圍局部組織灌注較差,酸性物質(zhì)無法被及時清除,造成酸性物質(zhì)的累積,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞外酸性微環(huán)境。目前測得的人類腫瘤微環(huán)境的pH值集中于5.5-7.0。細(xì)胞外酸性環(huán)境對于大多數(shù)正常細(xì)胞來說是有害的,甚至是致死性的,但是腫瘤細(xì)胞卻可以在這樣的環(huán)境中存活。腫瘤細(xì)胞在酸性環(huán)境中存活的具體機(jī)制雖然尚未明確,但是研究者已經(jīng)就酸性微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的影響進(jìn)行了研究。一方面,腫瘤酸性微環(huán)境可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。早在上世紀(jì)90年代,就有研究者發(fā)現(xiàn),細(xì)胞外酸性微環(huán)境可以誘發(fā)細(xì)胞突變。后來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn),酸性培養(yǎng)基處理可以造成腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的增強(qiáng),乳酸的大量產(chǎn)生可以幫助腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸等。另一方面,腫瘤細(xì)胞周圍酸性微環(huán)境也會造成腫瘤細(xì)胞周期停滯,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)壓力反應(yīng)及凋亡,從而對腫瘤產(chǎn)生抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)表明,酸性微環(huán)境會對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生廣泛而復(fù)雜的影響。所有的活細(xì)胞都受到氧化壓力的影響�；钚匝�(reactive oxygen species, ROS)是氧化壓力最重要的來源,它可以被廣義的定義為含有氧原子的活性分子。ROS在癌癥中的作用是多重性的。低中水平的ROS可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘發(fā)突變,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。而高水平ROS可以導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損傷,甚至造成細(xì)胞死亡。腫瘤細(xì)胞增殖速度快,因此對ATP的需求量很大。腫瘤細(xì)胞在產(chǎn)生能量的同時,也積累了大量ROS,腫瘤細(xì)胞需要清除ROS,才能存活下去。因此,腫瘤細(xì)胞被認(rèn)為需要具有很高的抗氧化能力來調(diào)節(jié)ROS水平,以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。之前的研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)短期酸性條件處理后,腫瘤細(xì)胞ROS水平增高,而長期酸性條件下腫瘤細(xì)胞ROS水平情況尚無報道。自噬是細(xì)胞對自身受損細(xì)胞器和變性蛋白質(zhì)等成分進(jìn)行降解并重新利用的過程,該過程高度保守,對于細(xì)胞命運起著重要的作用。自噬參與維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),正常細(xì)胞中也可以檢測到低水平的自噬。當(dāng)受到壓力或者刺激(例如乏氧、饑餓、感染、電離輻射等)時,自噬可以通過對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的重新利用幫助細(xì)胞生存,但是過高或者過低水平的自噬會導(dǎo)致細(xì)胞走向死亡。自噬與ROS存在互相作用。一方面,高水平的ROS可以誘發(fā)自噬,另一方面,自噬也可以對ROS水平產(chǎn)生影響。已經(jīng)有研究者發(fā)現(xiàn),長期酸性條件處理的乳腺癌細(xì)胞中自噬水平增高,且該細(xì)胞的生存依賴于自噬。以上發(fā)現(xiàn)均表明,酸性微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞有著重要的影響。前人所做研究絕大多數(shù)是對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行數(shù)小時到數(shù)天不等的短期酸性條件處理,而實際上,腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)是長期處于酸性微環(huán)境中的。那么長期酸性條件會使腫瘤細(xì)胞會受到怎樣的影響呢?針對該問題,我們以人結(jié)腸癌細(xì)胞系為對象進(jìn)行了研究,并得到以下三部分結(jié)果：第一部分適應(yīng)酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征為了了解長期酸性條件對結(jié)腸癌細(xì)胞的影響,我們用酸性培養(yǎng)基(pH 6.5)對人結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT15、HCT116、LoVo和SW480,均為結(jié)腸腺癌細(xì)胞)進(jìn)行不少于三個月的處理,期間適時進(jìn)行細(xì)胞傳代。HCT15、HCT116和LoVo細(xì)胞可以得到適應(yīng)酸性微環(huán)境的細(xì)胞(即extended/6.5細(xì)胞,記作-ext細(xì)胞),而SW480細(xì)胞無法耐受三個月的酸性條件處理。為了明確長期酸性培養(yǎng)基處理對結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的影響,我們用顯微鏡觀察經(jīng)酸性培養(yǎng)基短期及長期處理的HCT15、HCT116和SW480細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn),經(jīng)過酸性培養(yǎng)基處理3天的HCT15和HCT116細(xì)胞的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生變化：細(xì)胞變得纖長,細(xì)胞密度降低,且這種現(xiàn)象在HCT15-ext和HCT116-ext細(xì)胞中表現(xiàn)更為明顯。但是SW480細(xì)胞的形態(tài)變化不明顯。由于酸性條件處理下HCT15和HCT116細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變與發(fā)生EMT的細(xì)胞非常相似,我們通過實時熒光定量PCR以及Western Blotting的方法對EMT相關(guān)基因進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于HCT15細(xì)胞,HCT15-ext細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)記物在轉(zhuǎn)錄以及蛋白水平上表達(dá)下調(diào),而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果說明適應(yīng)了酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生了EMT。接下來我們對適應(yīng)了酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期分布及凋亡情況進(jìn)行檢測。我們用EdU摻入的方法對短期及長期酸性培養(yǎng)基處理后HCT15和HCT116細(xì)胞的增殖率進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過3天和3個月以上酸性培養(yǎng)基處理的HCT15細(xì)胞的增殖率均低于對照組細(xì)胞。HCT116細(xì)胞也得到類似結(jié)果。說明酸性微環(huán)境可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。接下來,我們用流式細(xì)胞術(shù)的方法對HCT15細(xì)胞、經(jīng)酸性培養(yǎng)基短期處理的HCT15細(xì)胞以及HCT15-ext細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)酸性培養(yǎng)基進(jìn)行短期處理的HCT15細(xì)胞即發(fā)生G1期的阻滯,且HCT15-ext細(xì)胞仍保持了G1期阻滯的特點。HCT116細(xì)胞和LoVo細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測也得到相似結(jié)果。用Annex V和PI雙染的方法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HCT15-ext細(xì)胞的凋亡比例低于HCT15細(xì)胞,HCT116-ext細(xì)胞也是如此。另外,Western Blotting檢測BAX和BCL-2的表達(dá)水平也支持該結(jié)論。以上結(jié)果說明適應(yīng)了酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖率下降,呈現(xiàn)G1期停滯并且凋亡受到抑制。綜上所述,適應(yīng)了酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征發(fā)生了一系列改變,表現(xiàn)在間質(zhì)化顯現(xiàn)、增殖減緩、G1期停滯以及凋亡水平降低。第二部分GSH在結(jié)腸癌細(xì)胞適應(yīng)酸性微環(huán)境過程中的作用之前已經(jīng)有研究者發(fā)現(xiàn),短期的酸性培養(yǎng)基處理會使細(xì)胞的ROS水平增高。為明確經(jīng)酸性培養(yǎng)基長期處理的結(jié)腸癌細(xì)胞的ROS水平,我們用流式細(xì)胞術(shù)對HCT15細(xì)胞、酸性培養(yǎng)基處理4h的HCT15細(xì)胞以及HCT15-ext細(xì)胞的ROS水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)酸性培養(yǎng)基處理4h的HCT15細(xì)胞的ROS水平高于對照細(xì)胞,而HCT15-ext細(xì)胞的ROS水平低于對照細(xì)胞。HCT116細(xì)胞和LoVo細(xì)胞的ROS水平也表現(xiàn)出同樣的趨勢。該結(jié)果說明適應(yīng)了酸性環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞的ROS水平普遍低于對照細(xì)胞,這是一種有趣的現(xiàn)象。還原型谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化物,可能參與維持適應(yīng)酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞的低水平ROS。為了明確這一點,我們用實時熒光定量PCR、Western Blotting和流式細(xì)胞術(shù)的方法對GSH相關(guān)的基因進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,相比于HCT15細(xì)胞,HCT15-ext細(xì)胞中幫助產(chǎn)生和維持GSH的基因在轉(zhuǎn)錄以及蛋白水平上表達(dá)上調(diào),而參與GSH降解的基因下調(diào)。另外,GSR、 CD44以及GPXs本身具有抗氧化性。HCT116和HCT116-ext細(xì)胞中也得到了相似的結(jié)果。接下來,我們使用GSH和GSSG檢測試劑盒對GSH的含量進(jìn)行測定,結(jié)果顯示HCT15-ext細(xì)胞中GSH含量以及GSH/GSSG比率均明顯高于對照細(xì)胞。這提示我們,在適應(yīng)了酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞中,GSH可能參與維持低水平ROS。為了證明GSH對適應(yīng)了酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞的生存以及ROS水平的影響,我們用馬來酸二乙酯(DEM,一種GSH耗竭劑)、丁硫氨酸亞砜胺(BSO,一種GCL抑制劑)以及GSR siRNA對HCT15細(xì)胞和HCT15-ext細(xì)胞進(jìn)行處理,通過MTT和平板克隆形成實驗來評價GSH水平對這兩種細(xì)胞生存的影響,并用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測ROS水平的變化。實驗結(jié)果顯示,相比于對照組細(xì)胞,HCT15-ext細(xì)胞對DEM、BSO和GSR siRNA的敏感度更高,且經(jīng)BSO和GSR siRNA處理的結(jié)腸癌細(xì)胞的ROS水平高于對照處理組。HCT116和HCT116-ext細(xì)胞也得到相似結(jié)果。以上結(jié)果說明,適應(yīng)酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞中ROS水平降低,以GSH為中心的抗氧化物幫助維持ROS低水平,且GSH對長期酸性條件下結(jié)腸癌細(xì)胞的生存起到重要的作用。第三部分自噬在結(jié)腸癌細(xì)胞適應(yīng)酸性微環(huán)境過程中的作用有研究者報道稱,用酸性培養(yǎng)基對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231進(jìn)行3個月的處理后,該細(xì)胞的自噬水平增高,且自噬是該細(xì)胞在慢性酸性微環(huán)境中的生存所依賴的。為明確結(jié)腸癌細(xì)胞在長期酸性環(huán)境下的生存是否也依賴自噬,我們用實時熒光定量PCR和Western Blotting的方法對自噬相關(guān)基因進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)相比于HCT15細(xì)胞,HCT15-ext細(xì)胞中自噬相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄以及蛋白水平上的表達(dá)均提示自噬水平的增高。另外,用透射電鏡對HCT15和HCT15-ext進(jìn)行觀察,可以看到HCT15-ext的自噬水平明顯高于HCT15細(xì)胞。HCT116和HCT116-ext細(xì)胞也得到類似結(jié)果。LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比例增高以及電鏡下觀察到雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體都是自噬發(fā)生的標(biāo)志。因此,我們可以得出結(jié)論,適應(yīng)酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬水平高于對照細(xì)胞。接下來,為了明晰自噬對于適應(yīng)了酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞的重要性,我們用自噬抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA)以及ATG5 siRNA對HCT15和HCT15-ext細(xì)胞進(jìn)行處理后,檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),自噬被抑制后HCT15-ext細(xì)胞凋亡水平有明顯的增高,而HCT15細(xì)胞變化不大。相似的結(jié)果在HCT116和HCT116-ext細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果都說明,適應(yīng)了酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞的生存依賴于自噬。目前研究認(rèn)為,自噬和ROS之間可以相互影響。由于適應(yīng)了酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞中自噬水平增高,為了明確自噬對于酸性微環(huán)境中長期存活的結(jié)腸癌細(xì)胞中ROS水平的降低是否起作用,我們用3-MA以及ATG5 siRNA對HCT15細(xì)胞和HCT15-ext細(xì)胞進(jìn)行處理,然后檢測它們的ROS水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過3-MA和ATG5 siRNA處理后,HCT15-ext細(xì)胞和HCT15細(xì)胞的ROS水平均降低,且HCT116和HCT116-ext細(xì)胞也得到類似結(jié)果。以上結(jié)果說明,在適應(yīng)了酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞中,自噬并未參與維持低水平ROS。該部分結(jié)果說明,適應(yīng)酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞中自噬水平增高,且自噬對于這種細(xì)胞的生存非常重要,但是自噬對適應(yīng)酸性微環(huán)境的結(jié)腸癌細(xì)胞中ROS的低水平并無貢獻(xiàn)。
[Abstract]:Cancer is becoming the first killer of human beings . The World Health Organization ( WHO ) released the World Cancer Report , 2014 . In 2012 , there was a significant increase in the incidence of cancer - related deaths ( 14 million ) and cancer - related deaths ( 8.2 million ) . In China , there were 69.4 million people dead in colorectal cancer . In order to maintain normal pH in tumor cells , the acidic microenvironment can induce cell mutation . HCT15 , HCT116 , LoVo and SW480 cells were treated with acidic medium ( pH 6.5 ) . The results showed that the expression of HCT15 , HCT116 , LoVo and SW480 cells in human colon cancer cells could not tolerate three months . The results showed that the levels of ROS in HCT15 - ext cells were higher than that of control cells . It was found that the autophagy levels of HCT15 - ext cells and HCT15 - ext cells were significantly higher than those in HCT15 cells and HCT15 - ext cells .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35
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本文編號：1829581