發(fā)布時間：2018-05-01 04:27

  本文選題：放射治療 + LCL161�。� 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分:SMAC模擬物L(fēng)CL161對食管癌細(xì)胞放射敏感性的影響及機制研究目的:觀察新型SMAC小分子模擬物L(fēng)CL161對食管癌細(xì)胞IAP蛋白家族表達(dá)的抑制情況,并在體外檢測LCL161對多個食管癌細(xì)胞株放射敏感性的影響,并探討LCL161增加食管癌細(xì)胞放射敏感性的分子機制。方法:選用3種食管鱗癌細(xì)胞株Eca109、TE13、KYSE150進(jìn)行研究,梯度濃度LCL161處理細(xì)胞后,采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)觀察LCL161對食管癌細(xì)胞增殖能力的影響。分別給予LCL161單藥、6MV X線單純照射或LCL161聯(lián)合X線照射處理后,平板克隆形成實驗觀察LCL161(5μmol/L)對食管癌放射敏感性的影響;Annexin V-PI雙染色后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率;采用免疫熒光技術(shù)觀察照射前后不同時間點細(xì)胞磷酸化γH2AX焦點數(shù)量,評價DSBs修復(fù)動力學(xué)改變;應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western-blot)測定LCL161處理后細(xì)胞XIAP、c-IAP1、c-IAP2表達(dá)變化,并檢測各處理組凋亡相關(guān)蛋白水平;反轉(zhuǎn)錄PCR法和ELISA法分別檢測受照細(xì)胞合成和分泌的TNFα水平。結(jié)果:LCL161單藥處理對食管癌細(xì)胞沒有明顯增殖抑制作用,其作用于Eca109、TE13細(xì)胞株半抑制率濃度IC50值均大于200μmol/L�？寺⌒纬蓪嶒灡砻�,與對照組相比加用5μmol/L LCL161可顯著降低3種食管癌細(xì)胞照射后的集落形成能力,其對三種細(xì)胞株的放射增敏比SER分別為1.42、2.0、1.64。γH2AX焦點分析表明LCL161顯著增加放射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂,并抑制腫瘤細(xì)胞DSBs修復(fù)能力。LCL161使放射線導(dǎo)致的食管癌細(xì)胞凋亡率明顯增加,且在TE13、KYSE150細(xì)胞中,聯(lián)合治療組與單純放射組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。但LCL161沒有增加正常細(xì)胞NIH3T3受照射后的凋亡水平。LCL161對腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用可以被泛caspases抑制劑z-VAD-FMK所阻斷。與NIH3T3相比,三種食管癌細(xì)胞株均呈現(xiàn)IAP蛋白家族過表達(dá),LCL161顯著抑制食管癌細(xì)胞c-IAP1蛋白表達(dá)水平,此效應(yīng)呈現(xiàn)濃度依賴性,而對其他IAP蛋白的表達(dá)沒有明顯影響。此外LCL161聯(lián)合放射處理的Eca109細(xì)胞活化caspase-8表達(dá)量顯著高于單純放射處理組,同時TNFα的表達(dá)和分泌量也顯著增加,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:食管癌細(xì)胞株較正常細(xì)胞過表達(dá)XIAP、c-IAP1、c-IAP2,LCL161可能是通過抑制c-IAP1表達(dá),增加放射誘導(dǎo)的細(xì)胞caspase-8活化以及TNFα合成分泌,從而依賴死亡受體通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮放射增敏作用。但LCL161并不增加正常組織細(xì)胞對放射線的敏感性,因而是具有臨床應(yīng)用前景的腫瘤靶向放射增敏劑。第二部分:Survivin抑制劑YM155去除G_2期阻滯提高食管癌放射敏感性的研究目的:Survivin在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡增加腫瘤細(xì)胞放化療抵抗,YM155是survivin的小分子抑制劑,可增強多種抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性。本課題通過體內(nèi)移植瘤和體外細(xì)胞實驗觀察YM155對食管癌放射敏感性的影響,并探討其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA雙鏈斷裂修復(fù)等發(fā)揮放射增敏作用的分子機制。方法:采用MTT實驗檢測YM155單藥對食管癌細(xì)胞Eca109、TE13的增殖抑制作用;平板克隆形成實驗觀察YM155對這兩種細(xì)胞放射敏感性的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測單純放射治療、單純加藥、YM155與放射聯(lián)合對細(xì)胞周期分布的影響;免疫熒光染色檢測細(xì)胞核磷酸化γH2AX(綠色)、RAD51(紅色)焦點數(shù)量,以評價放射治療后細(xì)胞DNA雙鏈斷裂和修復(fù)動力學(xué)變化;蛋白印跡法(Western-blot)測定在YM155通過影響細(xì)胞周期進(jìn)程增加食管癌放射敏感性過程中,細(xì)胞內(nèi)Cdc2 Thr14/Tyr15磷酸化水平及cyclin B1等周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)變化。建立BALB/c裸鼠食管癌移植瘤模型,將24只裸鼠隨機分為四組分別給予生理鹽水、單藥YM155、單純放射治療、YM155聯(lián)合放射處理,觀察比較各組腫瘤生長、裸鼠體重差異,切取腫瘤組織切片免疫組化檢測survivin、cleaved caspase-3,TUNEL染色法行組織細(xì)胞凋亡原位檢測。結(jié)果:YM155可顯著增加食管癌細(xì)胞的放射敏感性,10nmol/L YM155對Eca109、TE13細(xì)胞的放射增敏比SER分別為1.51和1.73。細(xì)胞周期分析表明:X線照射可明顯導(dǎo)致兩種細(xì)胞G_2期阻滯,Eca109細(xì)胞照射前后的G_2期細(xì)胞比例分別為28.0%、62.5%,TE13細(xì)胞分別為23.9%、66.8%;YM155可顯著消除放射線導(dǎo)致的細(xì)胞G_2期阻滯,YM155聯(lián)合放射處理后Eca109細(xì)胞的G_2期比例下降為34.7%,TE13為36.4%。YM155對G_2期細(xì)胞阻滯的消除作用與其降低照射后細(xì)胞內(nèi)磷酸化Cdc2 Thr14/Tyr15含量,激活Cdc2-cyclin B1復(fù)合物激酶活性有關(guān)。免疫熒光染色表明Eca109細(xì)胞受照射后30min內(nèi)胞核染色體發(fā)生顯著雙鏈斷裂(DSBs),表現(xiàn)為綠色γH2AX熒光焦點,隨后綠色焦點隨時間延長而逐漸減少,同時紅色RAD51焦點數(shù)量逐漸增加,表明DSBs被細(xì)胞逐漸修復(fù)。而YM155+照射組在照射后的各個時間點的綠色焦點數(shù)目均顯著多于單純照射組,紅色焦點數(shù)目則顯著少于單純照射組(P0.05)。說明YM155抑制食管癌細(xì)胞對放射性DSBs的修復(fù)。裸鼠移植瘤研究表明,與對照組相比,單純加藥組、單純放射組和YM155聯(lián)合放射治療組的裸鼠移植瘤生長均有所延緩,各組腫瘤倍增時間分別為5.7±0.5天、9.0±1.6天、8.0±2.0天、17.6±6.5天,以聯(lián)合治療組的腫瘤生長延緩最為顯著,平均達(dá)11.9天。由此計算出YM155的放射增強因子(EF)為3.75。裸鼠移植瘤切片免疫組化檢測表明YM155單藥或與放射治療聯(lián)合使腫瘤組織的survivin表達(dá)強度明顯下降,三種治療組的caspase-3裂解片段量及TUNEL染色強度均較對照組增加,且以聯(lián)合治療組最為顯著(P0.01)。結(jié)論:對于人食管癌細(xì)胞系Eca109和TE13,YM155能夠消除放射導(dǎo)致的G_2期細(xì)胞停滯,其機制可能與抑制Cdc2 Thr14/Tyr15磷酸化、激活Cdc2的激酶活性有關(guān)。通過去除G_2期阻滯,YM155減弱腫瘤細(xì)胞修復(fù)放射性DNA雙鏈損傷的能力,從而增加細(xì)胞對放射線的敏感性。
[Abstract]:The effects of LCL161 ( 5 渭mol / L ) on the radiosensitivity of esophageal cancer cells were investigated by MTT assay . The results showed that YM155 inhibited the cell arrest of esophageal cancer cells after irradiation . The results showed that the expression intensity of the cells of Eca109 cells was significantly lower than that in the control group .

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1

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本文編號：1827695