本文選題：抗藥性 + NF-κB信號�。� 參考：《廣州醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景和目的一.非小細(xì)胞肺癌的治療耐受肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是一些不同起源的,具有高度異質(zhì)性的腫瘤的總稱,占據(jù)新診斷肺癌病例的85%以上(1)。目前已經(jīng)有多種方法應(yīng)用于NSCLC是二-二氨合鉑(II)(通常被稱為順鉑)。順鉑被用于治療多種惡性實(shí)體腫瘤,包括睪丸癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌和肺癌(2)。順鉑對于腫瘤細(xì)胞殺傷的作用機(jī)制多樣,但其最主要的作用模式為誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA損傷,隨后激活DNA損傷反應(yīng)和誘導(dǎo)線粒體凋亡。相對于正常細(xì)胞,這些DNA損傷更容易在快速增殖的腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生,因此利用順鉑治的治療,其中的一類重要的治療方法是凋亡誘導(dǎo)化療劑如,特別療多種腫瘤,包括NSCLC,在臨床上取得了一定的效果,有效延長了NSCLC病人的生存期(3)。然而,盡管接受順鉑治療的病人往往擁有較好的初始反應(yīng),該治療常常導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生化療耐藥性而導(dǎo)致治療失敗(3)。對于順鉑抗性的研究是目前針對NSCLC藥物開發(fā)和靶向治療的研究重點(diǎn),這些研究發(fā)現(xiàn)了順鉑抗性涉及到多個(gè)方面,其基本被分為四大類(4,5)。第一類涉及在腫瘤細(xì)胞中DNA損傷/修復(fù)蛋白的異�；钴S;第二類為腫瘤對藥物的吸收產(chǎn)生拮抗;第三類機(jī)制可能使得藥物在被吸收后失活或防止藥物到達(dá)DNA靶標(biāo);第四類機(jī)制通過不同途徑的生長信號傳導(dǎo)或抗細(xì)胞凋亡蛋白的增加。值得注意的是,順鉑抗性極大可能具有多種機(jī)制,并且抗性的機(jī)制可以根據(jù)細(xì)胞類型而不同。因而無論抗性機(jī)制如何被闡釋,以順鉑為主,結(jié)合其它治療而提高腫瘤對于順鉑的易感性成為了當(dāng)前的主要目標(biāo)和策略。最近的先進(jìn)化療策略包括多種藥物的聯(lián)合治療和分子水平的組織學(xué)/遺傳檢查,旨在針對不同的病人群體采取適當(dāng)?shù)牟呗詠碜畲蠡樸K的作用(6-8)。然而在一些臨床實(shí)驗(yàn)中,聯(lián)合治療依然未能控制早期(3-5周)的復(fù)發(fā)(3)。因此,研究對于順鉑耐受的NSCLC細(xì)胞亞群起作用的治療將是十分必要的,其有助于我們了解并逆轉(zhuǎn)這些細(xì)胞的抗性從而達(dá)到對于NSCLC的全面治療的目的。二.端粒結(jié)合蛋白的端粒外功能過去二十年的研究表明端粒功能障礙對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是至關(guān)重要的(9,10)。端粒功能障礙包括端粒序列的丟失、端粒結(jié)構(gòu)的異常和端粒酶異常調(diào)控,其在組織老化和組織再生中的作用是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。然而另一方面,一些在之前研究中被證明為端粒結(jié)合蛋白的因子,被發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)離端粒的不同位置仍具有結(jié)合位點(diǎn)。更重要的是,這些因子的部分功能是不依賴于端粒而存在的(11)。端粒結(jié)合蛋白的端粒外功能被發(fā)現(xiàn)與多種分子生物學(xué)現(xiàn)象相關(guān),如線粒體功能、炎癥、胚胎發(fā)育、基因表達(dá)調(diào)控、代謝、干細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞粘附和癌癥(12,13)。當(dāng)前的研究熱點(diǎn)著重于研究端粒酶和端粒結(jié)合蛋白復(fù)合物shelterin的端粒外功能和介導(dǎo)這些功能的其他因子(14)。更進(jìn)一步地,這些研究致力于在一個(gè)更全面的角度了解這些因子的生物學(xué)功能調(diào)控這些功能的詳細(xì)機(jī)制。這些研究將增強(qiáng)我們對于維持端粒結(jié)構(gòu)與其他分子生物學(xué)過程間聯(lián)系的了解,但也提供有價(jià)值的信息并有助于解釋人類遺傳疾病、老化和癌癥的發(fā)病機(jī)制,從而對人類健康和疾病治療做出貢獻(xiàn)。其中一個(gè)重要的例子是對于哺乳動物RAP1基因(抑制/激活蛋白-1,repressor/activator protein-1;或被稱為TRF2IP,端粒重復(fù)序列結(jié)合因子-2互作蛋白-1,telomeric repeat binding factor-2 interacting protein-1)(15)。哺乳動物的RAP1基因與出芽酵母Rap1具有同源性,而在酵母中的研究發(fā)現(xiàn),Rap1是酵母端粒的主要結(jié)合蛋白,且發(fā)揮控制端粒結(jié)構(gòu)的重要作用,集中表現(xiàn)在它保護(hù)端粒、招募相關(guān)因子和端粒酶來控制端粒長度的功能(16-18)。此外,除了在端粒,酵母Rap1也發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄因子的的作用,并通過控制糖酵解酶和核糖體相關(guān)基因的表達(dá)來控制酵母細(xì)胞的存活與增殖(19)。另一方面,對Rap1自身與端粒的結(jié)合并非十分透徹,一種理論認(rèn)為其直接結(jié)合端粒DNA,而另一種理論認(rèn)為RAP1被認(rèn)為是由TRF2募集到端粒(20,21)。最近研究也正在嘗試闡明Rap1基因在小鼠發(fā)育中的作用。目前,已有兩個(gè)不同的Rap1敲除小鼠模型通過Cre同源重組系統(tǒng)成功地敲除了Rap1的外顯子2和外顯子3,另一種小鼠模型在Rap1外顯子1和外顯子2之間產(chǎn)生插入失活(22,23)。然而,其中的一項(xiàng)研究報(bào)告了RAP1敲除導(dǎo)致胚胎發(fā)育在第6.5天至第45天期間的死亡(23);而在另一種情況下,Rap1的敲除則被發(fā)現(xiàn)它不影響小鼠的生存與生育(22)。通過組織特異性敲除的小鼠模型,一些研究發(fā)現(xiàn)Rap1在上皮細(xì)胞中的缺失并非致命,但是導(dǎo)致皮膚色素沉著過早的早期發(fā)病以及部分衰老和肥胖的表型,尤其是在雌性動物中(22)。這些看似矛盾的結(jié)果說明了闡明RAP1在哺乳動物,尤其是人類疾病中功能的重要性。三.哺乳動物RAP1基因的端粒外功能研究雖然對于RAP1的轉(zhuǎn)基因小鼠研究的成果有所爭議,在哺乳動物細(xì)胞以及組織中的研究則揭示了RAP1重要的獨(dú)立與端粒而存在的功能。通過使用染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合測序(ChIP-seq)技術(shù),Martinez等在其中一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)了Rap1的端粒外結(jié)合位點(diǎn),并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了這些位點(diǎn)共享有(TTAGGG)串聯(lián)的序列(11)。這些端粒外Rap1結(jié)合位點(diǎn)在亞端粒區(qū)域富集,而由這些區(qū)域的DNA序列所編碼的基因在具有Rap1缺陷的細(xì)胞中均有不同程度的下調(diào)(11)。與之類似的是,RAP1作為非端粒依賴性轉(zhuǎn)錄因子的作用能夠被一些特殊的增強(qiáng)子序列所放大。此外,Rap1亦在非基因編碼區(qū)的染色體上具有結(jié)合,同樣地,這些結(jié)合位點(diǎn)具有TTAGGG串聯(lián)重復(fù)的共同點(diǎn)(24)。Rap1的結(jié)合在這些區(qū)域的作用可能包括穩(wěn)定基因組和降低在這些區(qū)域重組的產(chǎn)生(24)。生物化學(xué)研究顯示相比于酵母的Rap1蛋白,哺乳動物的Rap1已經(jīng)失去了部分DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,這一現(xiàn)象也許有助于解釋Rap1對于哺乳動物細(xì)胞的端粒保護(hù)作用并非不可或缺(20)。然而同時(shí),Rap1也被發(fā)現(xiàn)可以與除TRF2以外的因子相互作用以幫助基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(15)�；蚍治鲲@示,在小鼠胚胎纖維細(xì)胞中,Rap1敲除后下調(diào)的基因涉及到多個(gè)信號通路,包括促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號、細(xì)胞粘附分子、代謝相關(guān)酶、胰島素合成相關(guān)基因、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)信號傳導(dǎo)分子和生長激素效應(yīng)分子等(17)。另一方面,Rap1敲除后的細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和涉及2型糖尿病的基因產(chǎn)生了顯著上調(diào)(17)。因此,Rap1的缺失能夠影響到多種生物學(xué)過程。而人類RAP1在端粒之外的另一個(gè)作用則是由其在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)而介導(dǎo)的(25)。通過全基因組功能篩選,人們發(fā)現(xiàn)RAP1被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核調(diào)節(jié)因子-κB(NF-κB)信號通路中扮演重要作用。在多種人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),過表達(dá)的RAP1能夠誘導(dǎo)NF-κB信號,而RAP1缺陷則會抑制NF-κB活性。在這些細(xì)胞中,RAP1的表達(dá)不僅位于端粒,甚至不局限于細(xì)胞核;一部分RAP1分子被發(fā)現(xiàn)位于細(xì)胞質(zhì)中,成為一些大分子復(fù)合物的組成成分。免疫共沉淀的結(jié)果顯示,RAP1與抑制性NF-κB激酶(IKK)復(fù)合物(IKKA-IKKB-IKKG)具有直接結(jié)合,而這種結(jié)合這對于NF-κB中p65亞基的磷酸化是必需的。NF-κB的亞基和IKKB抑制劑,使NF-κB以招募必要的染色質(zhì)重塑蛋白用于靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。RAP1與IKK復(fù)合物的結(jié)合起到了穩(wěn)定該復(fù)合物的作用,從而使其能夠介導(dǎo)p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)位,這一過程使得NF-κB下游基因的轉(zhuǎn)錄被激活。這一發(fā)現(xiàn)對于RAP1在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用提供了另一個(gè)角度的解釋。有趣的是,這兩者之間互為正反饋調(diào)節(jié)的關(guān)系:在RAP1激活NF-κB信號通路的同時(shí),RAP1的表達(dá)水平也受到NF-κB信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)。目前,在RAP1基因的啟動子區(qū)域已發(fā)現(xiàn)兩個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。因此,在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的RAP1是一個(gè)NF-κB信號通路重要的激活分子。雖然除去TRF2以外,并沒有新的分子被發(fā)現(xiàn)能夠和RAP1結(jié)合并介導(dǎo)其端粒外功能,RAP1的功能已被確定是可以獨(dú)立于端粒而存在的。更重要的是,RAP1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的不同表達(dá)為其通過不同機(jī)制而影響細(xì)胞學(xué)過程提供了可能,同時(shí)這樣的分布也使得RAP1可受到多重調(diào)控(16,26)。如RAP1募集到端粒是TRF2依賴的,而與端粒結(jié)合的TRF2的數(shù)量可以依細(xì)胞類型、分化程度、胚胎發(fā)育和年齡的不同而不同(23)。未與端粒結(jié)合的RAP1可能是一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的方式控制幾種生物過程,如炎癥反應(yīng)和代謝(17)。作為控制細(xì)胞衰老的重要機(jī)制,RAP1水平(端粒結(jié)合與非端粒結(jié)合)可能隨著衰老而降低,從而影響基因表達(dá)的變化,從而產(chǎn)生衰老相關(guān)的表型。特別地,NF-κB途徑的失調(diào)已經(jīng)與人類疾病,尤其是癌癥相關(guān)(27)。NF-κB信號的持續(xù)激活已被證明有助于肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。由于RAP1對于該信號通路的激活作用,其端粒外功能勢必對于腫瘤發(fā)生起到一定作用。在這方面,Teo等發(fā)現(xiàn)相較于鄰近正常細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞中的RAP1水平顯著升高;同時(shí),RAP1的表達(dá)水平腫瘤的惡性級別之間的正相關(guān)性也在乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)(25)。這些腫瘤中p65的激活狀況以及該激活對于RAP1的依賴性仍有待解決。四.問題的提出上述研究成果集中體現(xiàn)了RAP1在端粒外行使重要功能,對于不同信號通路能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的調(diào)節(jié)。特別地,RAP1是一個(gè)必要以及重要的NF-κB信號正調(diào)控因子,而該信號通路在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到核心作用。持續(xù)活化的NF-κB信號促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖,更重要的是介導(dǎo)其耐藥性。尤其是對于順鉑的耐藥,其已在多種腫瘤中被證明與NF-κB的激活相關(guān)。然而,RAP1基因本身在NSCLC中的功能研究依然十分缺乏�；诖�,我們開展了對于RAP1介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞生長、凋亡和順鉑抗性的研究(詳見研究結(jié)果部分)。在此項(xiàng)研究中我們發(fā)現(xiàn):(A)細(xì)胞質(zhì)中的RAP1在NSCLC組織中的表達(dá)與腫瘤惡性程度呈一定正相關(guān)性;(B)細(xì)胞質(zhì)RAP1在NSCLC細(xì)胞中過表達(dá);(C)RAP1在NSCLC細(xì)胞中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖與順鉑耐藥的作用,而這一作用是通過上調(diào)NF-κB依賴性的抗凋亡蛋白BCL-2來完成的;(D)具有RAP1缺陷的NSCLC細(xì)胞對于順鉑的易感性增強(qiáng);(E)RAP1對于順鉑耐藥NSCLC細(xì)胞的存活是必需的。我們的研究結(jié)果表明RAP1的腫瘤進(jìn)展的端粒外功能,并建議RAP1可以成為順鉑耐藥NSCLC的治療靶點(diǎn)。研究結(jié)果簡述一.細(xì)胞質(zhì)RAP1與NSCLC惡性程度之間的關(guān)系根據(jù)參考文獻(xiàn)中的報(bào)道,在乳腺癌組織中曾檢測到細(xì)胞質(zhì)RAP1,并且其在病理切片中的表達(dá)量與腫瘤級別呈正相關(guān)(25)。因此我們提出了細(xì)胞質(zhì)RAP1是高級別NSCLC的生物標(biāo)志物的假說。為了驗(yàn)證這一假說,我們利用免疫組化在93個(gè)肺腺癌和75個(gè)肺鱗狀細(xì)胞癌組織中測定了RAP1的細(xì)胞質(zhì)和核表達(dá)量。瘤旁正常組織用于反映非惡性細(xì)胞中的RAP1表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,NSCLC腫瘤細(xì)胞質(zhì)和核RAP1均增加,但細(xì)胞質(zhì)RAP1的差異似乎更大。同時(shí),細(xì)胞質(zhì)RAP1高表達(dá)(n=33,表達(dá)量0.4)和RAP1低表達(dá)(n=59,表達(dá)量0.4)腺癌患者之間的存活率進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析后,我們得出了較高的細(xì)胞質(zhì)RAP1表達(dá)與腺癌患者預(yù)后較差有關(guān)這一結(jié)論。這些結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)RAP1成為高級別NSCLC的診斷指標(biāo)提供了可能性,同時(shí)表明細(xì)胞質(zhì)RAP1可能在癌癥進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。二.RAP1與NSCLC細(xì)胞生長之間的關(guān)系利用肺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn),我們比較了三種NSCLC細(xì)胞系和兩種肺上皮細(xì)胞系之間RAP1的表達(dá),包括腺癌細(xì)胞A549和PC9,以及鱗癌細(xì)胞HCC827,而正常細(xì)胞包括支氣管上皮細(xì)胞16HBE和小氣道上皮細(xì)胞HSAEC1-KT。在NSCLC細(xì)胞中,與正常肺上皮細(xì)胞相比,我們檢測到RAP1具有整體較高的mRNA和蛋白表達(dá),而這樣的高表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中更加明顯。由于目前尚無特異性抑制細(xì)胞質(zhì)RAP1的技術(shù),我們使用shRNA進(jìn)行RAP1敲低來研究其對于肺癌細(xì)胞生長的作用。RAP1敲低后的三株NSCLC細(xì)胞在培養(yǎng)過程中均表現(xiàn)出生長速度的減慢。這一結(jié)論在測定細(xì)胞數(shù)量與克隆形成率的實(shí)驗(yàn)中均得到證實(shí)。這些結(jié)果表明RAP1是A549細(xì)胞生長所必需的。三.RAP1在NSCLC細(xì)胞中介導(dǎo)NF-κB信號通路的激活由于RAP1本身不足以形勢保護(hù)端粒的作用(22),細(xì)胞核中的RAP1在維持過度增殖的腫瘤細(xì)胞中的基因組穩(wěn)定性方面的作用也是有限的。因此,我們推測細(xì)胞質(zhì)RAP1是誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的主要原因。以前的研究證明,細(xì)胞質(zhì)RAP1可以介導(dǎo)NF-κB信號通路中的重要因子p65的磷酸化(25)。而在A549細(xì)胞中RAP1被敲低時(shí),我們也觀察到細(xì)胞核中磷酸化的p65的減少。促進(jìn)NF-κB信號傳導(dǎo)的磷酸化IκBα也隨著RAP1的缺失而降低�；罨腘F-κB能夠促進(jìn)IL-1,MCP-1和CD44基因的轉(zhuǎn)錄,而RAP1的敲低導(dǎo)致這些基因表達(dá)的下調(diào)。這些結(jié)果表明NSCLC細(xì)胞的增殖由RAP1介導(dǎo)的NF-κB活化來進(jìn)行正向調(diào)節(jié)。四.RAP1介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞中的順鉑抗性活化的NF-κB已被證明能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞產(chǎn)生對化療藥物的抗性(27,28)。尤其是在NSCLC中,CD44這一NF-κB通路的下游靶基因恰好是順鉑(Cisplatin,CP)抗性細(xì)胞亞群的表面標(biāo)志物之一(29)。因此,我們猜想RAP1介導(dǎo)了NSCLC細(xì)胞對CP的抗性。為了驗(yàn)證這一猜測,我們首先用不同濃度的CP處理RAP1 shRNA或scramble shRNA(對照組)轉(zhuǎn)導(dǎo)的A549細(xì)胞48小時(shí)。相對高劑量的CP(2μM)清除了兩組中幾乎所有的細(xì)胞。然而,當(dāng)使用較低濃度的CP時(shí),相較于對照組,RAP1缺失的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。接下來,我們研究過表達(dá)的RAP1對CP抗性的影響。評估了用對照組或RAP1過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后A549細(xì)胞的增殖。出乎意料的是,當(dāng)A549細(xì)胞過表達(dá)RAP1后,它們的生長速度增加并不明顯;然而,它們對于CP的抗性則顯著增加了。為了進(jìn)一步了解RAP1介導(dǎo)的CP抗性,我們進(jìn)行了“競爭性增殖”的實(shí)驗(yàn),將正常的A549細(xì)胞(GFP-)與RAP1過表達(dá)或敲低的細(xì)胞(GFP+)以1:1的比例混合,并用2μM的CP處理24h或72h。與正常細(xì)胞相比,在這樣的CP濃度條件下,RAP1過表達(dá)的細(xì)胞明顯具有增殖優(yōu)勢而RAP1敲低后的細(xì)胞生長受到顯著的抑制,表明了RAP1能夠介導(dǎo)對于CP的抗性。CP的作用是通過在增殖性癌細(xì)胞中產(chǎn)生DNA損傷,而最終導(dǎo)致其凋亡。然而,RAP1本身似乎對CP誘導(dǎo)的DNA損傷似乎沒有顯著影響。因此,我們懷疑RAP1的功能在于控制產(chǎn)生DNA損傷的細(xì)胞使其免于凋亡。為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們將未用慢病毒處理的(UnTx D)A549細(xì)胞和具有RAP1過表達(dá)(RAP1)或RAP1敲低(shRAP1)的A549細(xì)胞在含有1μM CP(+)或無CP培養(yǎng)基(-)中培養(yǎng)24h,并分析cleaved caspase-3(C-Cas3)和BCL-2,以及利用Annexin-V的流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡的情況。在具有過表達(dá)的RAP1的細(xì)胞中,CP沒有引發(fā)cleaved caspase-3的明顯上調(diào);相比之下,在RAP1敲低的細(xì)胞中,短時(shí)間的CP處理即誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生了大量的cleaved caspase-3。類似地,在RAP1過表達(dá)細(xì)胞中,CP處理后Annexin-V+凋亡細(xì)胞的比例降低;反之,RAP1缺失的細(xì)胞中,該比例增加。當(dāng)檢測抗凋亡因子BCL-2時(shí),我們發(fā)現(xiàn)RAP1和BCL-2表達(dá)之間呈正相關(guān),且這一現(xiàn)象在未經(jīng)CP處理時(shí)就已發(fā)現(xiàn)。利用CP處理后,在對照組和RAP1過表達(dá)的細(xì)胞中BCL-2表達(dá)量略有上升,其中的原因可能是CP誘導(dǎo)凋亡后的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。然而,當(dāng)利用CP處理RAP1敲低的細(xì)胞后,在依然存活的細(xì)胞中BCL-2幾乎沒有增加,表明RAP1對于BCL-2的上調(diào)具有必要性。因此,我們可以得出結(jié)論,RAP1抑制CP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生CP抗性。五.順鉑抗藥性與RAP1依賴性的NF-κB活化為了進(jìn)一步研究RAP1表達(dá)與CP抗性之間的相關(guān)性,我們用持續(xù)增加劑量的CP來處理A549細(xì)胞以產(chǎn)生具有不同程度的耐藥性的細(xì)胞,并在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對于存活下來的細(xì)胞取樣以研究RAP1表達(dá)。我們首先發(fā)現(xiàn),這樣的CP處理導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)而非細(xì)胞核中RAP1的增加。同時(shí)增加的還有NF-κB活性相關(guān)的因子,如pp65和p-IκBα的變化所示。值得注意的是,相較于RAP1表達(dá)量的變化,pp65和p-IκBα的增加表現(xiàn)出一定的延遲,說明這些因子很可能位于RAP1的下游。用RT-PCR分析NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)靶基因的mRNA表達(dá)能夠看出,在持續(xù)的CP過程中,IL-1,MCP-1和CD44的轉(zhuǎn)錄也被促進(jìn),這進(jìn)一步證明了NF-κB信號通路的激活。為了闡明RAP1在CP激活NF-κB信號通路這一過程中的作用,我們利用與前述類似的遞增濃度的CP對RAP1過表達(dá)和RAP1敲低的細(xì)胞進(jìn)行處理。我們發(fā)現(xiàn)RAP1過表達(dá)細(xì)胞中基礎(chǔ)NF-κB活性與對照組相比明顯上升,并在CP處理后進(jìn)一步加強(qiáng)。然而,在持續(xù)的CP處理后,RAP1過表達(dá)細(xì)胞與對皂秀之間的NF-κB活性沒有顯著差異,這可能是由于持續(xù)的CP處理使得NF-κB活性達(dá)到了飽和狀態(tài)。此外,當(dāng)相同的CP遞增濃度的處理作用于RAP1敲低的細(xì)胞中時(shí),我們發(fā)現(xiàn)0.5μM的CP即對RAP1敲低的細(xì)胞具有相當(dāng)大的毒性,而1μM的CP幾乎消除了所有的細(xì)胞。這兩種濃度對于對照組則并無明顯的毒性。更重要的是,當(dāng)使用0.1μM和0.5μM的CP去處理RAP1敲低的細(xì)胞后,雖然仍有部分細(xì)胞存活,但在存活的細(xì)胞中,NF-κB的活性并沒有上升。因此,RAP1可被看做是CP誘導(dǎo)NF-κB活化的重要中間介質(zhì),或者說RAP1對于在CP治療中存活(具有CP抗性)的細(xì)胞中NF-κB的活化是必要的。并且,鑒于以往研究發(fā)現(xiàn)NF-κB能夠直接調(diào)節(jié)BCL-2基因的轉(zhuǎn)錄(30),我們得出的結(jié)論是RAP1-NFκB-BCL2調(diào)節(jié)通路在肺癌細(xì)胞中能夠介導(dǎo)CP抗性。六.RAP1對于順鉑耐藥NSCLC細(xì)胞存活的必要性上述研究證明了RAP1具有抑制CP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用,并且抑制RAP1的表達(dá)能夠增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞對于CP的易感性。于是我們從相反的角度進(jìn)行設(shè)想:當(dāng)細(xì)胞已經(jīng)具有了CP抗性,RAP1的缺失會對其有何影響?為解答這一問題,我們首先使用在先前的研究中所描述的方案(31,32)獲得了具有CP抗性的A549細(xì)胞(A549R)。首先注意到的是,A549R細(xì)胞相較于正常的A549細(xì)胞,具有更高的細(xì)胞質(zhì)RAP1表達(dá)量與NF-κB活性。同時(shí)與正常A549細(xì)胞相比,A549R細(xì)胞中BCL-2的表達(dá)要高得多,不過這可能是由于這些細(xì)胞必須使用含有CP的培養(yǎng)基來維持其抗性。由于前述研究已闡明RAP1能夠介導(dǎo)CP抗性,我們首先試圖通過敲低RAP1來減弱A549R細(xì)胞中的CP抗性。然而意想不到的是,sh-RAP1處理后的A549R細(xì)胞幾乎無法存活。這一現(xiàn)象不僅可以通過CCK-8細(xì)胞存活率檢測來說明,甚至可以在顯微鏡下清楚地發(fā)現(xiàn)。由于A549R的CP抗性需要使用含有CP的培養(yǎng)基來維持,我們?nèi)孕枰懦@些CP使得細(xì)胞死亡的可能性。因此,在敲低RAP1之前,我們將A549R細(xì)胞培養(yǎng)在無CP培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。這種“CP清除”的過程并不影響細(xì)胞的CP抗性,但是經(jīng)過處理后的細(xì)胞在RAP1敲低之后仍然不能存活超過7天。將RAP1缺失的A549細(xì)胞和加擾shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的A549R細(xì)胞在含有1μMCP(+)或無CP培養(yǎng)基(-)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí),然后裂解收獲蛋白質(zhì)。通過對于這些細(xì)胞的進(jìn)一步分析,我們發(fā)現(xiàn)在RAP1敲低后的A549R細(xì)胞中,cleaved caspase-3出現(xiàn)明顯上調(diào),而BCL-2幾乎完全消失,即使這些細(xì)胞在RAP1敲低前已經(jīng)經(jīng)過“CP清除”的過程。Cleaved caspase-3上調(diào)的程度與RAP1敲低的A549細(xì)胞經(jīng)CP處理后的情況相似。與此相一致的是通過Annexin-V染色后所發(fā)現(xiàn)的,在RAP1敲低的A549R細(xì)胞中顯著增加的細(xì)胞凋亡比例。因此,在A549R細(xì)胞中,RAP1表達(dá)量的下降足以通過細(xì)胞凋亡的高度激活而清除細(xì)胞,這一過程甚至不需要進(jìn)一步的CP處理。結(jié)論順鉑(CP)是一種常見的抗癌藥物,通過誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA損傷來導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在NSCLC細(xì)胞中,CP的抗性與細(xì)胞質(zhì)中的RAP1密切相關(guān)。細(xì)胞質(zhì)中的RAP1在CP處理后上調(diào),進(jìn)而介導(dǎo)NF-κB信號的激活;激活的NF-κB調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄,其中包括重要的凋亡抑制因子BCL-2。RAP1的激活則很有可能是細(xì)胞中DNA損傷反應(yīng)的一部分。因此,RAP1通過激活NF-κB信號傳導(dǎo)來誘導(dǎo)抗凋亡蛋白BCL-2的上調(diào),從而在不明顯改變DNA損傷情況的狀態(tài)下抑制細(xì)胞凋亡,來實(shí)現(xiàn)CP的抗性。這些發(fā)現(xiàn)表明細(xì)胞質(zhì)RAP1可能在順鉑耐藥性癌癥治療中具有重要的臨床意義。首先,RAP1可以作為NSCLC不良預(yù)后相關(guān)的重要標(biāo)記;其次,RAP1可用于鑒定NSCLC病例是否適用于CP的治療;最后,針對RAP1的靶向治療是一種與CP進(jìn)行聯(lián)合治療的可行性方案。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：1823059