本文選題：NOB1 + 非小細胞肺癌　； 參考：《山東大學》2015年博士論文

【摘要】：肺癌是世界上引起死亡最多的癌癥之一。據(jù)最新的統(tǒng)計研究表明,肺癌是在男性中致死率最高的癌癥,而在女性中,尤其是發(fā)展中國家的女性中,其致死率也非常高。另外根據(jù)相關權威統(tǒng)計,2008年我國肺癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤第1位,發(fā)病率達57個/10萬,死亡率為46個/10萬,并且肺癌死亡的病人約占國內(nèi)癌癥死亡總?cè)藬?shù)的22.7%。因此,研究肺癌的發(fā)病機制以及治療手段非常急迫,對延長患者的生存率具有重要的意義。肺癌主要包括小細胞肺癌(small-cell lung carcinoma, SCLC)和非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma, NSCLC)。其中,SCLC約占肺癌總數(shù)的20%,NSCLC約占肺癌總數(shù)的80%。小細胞肺癌是一種以生長迅速、早期轉(zhuǎn)移、高度侵襲性為特點的肺癌類型。非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma, NSCLC)主要包括鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma)、腺癌(lung adenocarcinoma)和大細胞癌(pulmonary large cell carcinoma)三種。與小細胞癌相比,非小細胞肺癌細胞生長分裂較慢,轉(zhuǎn)移擴散相對較晚,因此惡性程度較低。盡管如此,由于約75%的患者被發(fā)現(xiàn)患病時已處于中晚期,癌細胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移,難以根治,因此5年生存率仍然很低。由于非小細胞肺癌占肺癌總數(shù)的大多數(shù),因此,亟待開發(fā)有效的治療非小細胞肺癌的方法。人類的NOB 1 (Nin1/RPN12-binding Protein1, NOB1)基因定位于染色體的16q22.1,包含9個外顯子和8個內(nèi)含子,其cDNA全長為1749bp,包含一個開放閱讀框,有1271bp長,編碼412個氨基酸序列的蛋白,分子量46kDa。NOB1蛋白具有兩個非常保守的結(jié)構域,即位于NOB1蛋白N端的PIN(Pi1Taminoterminus, PIN)結(jié)構域和位于其C端的ZNRD1 (zinc ribbon domain containing 1,ZNRD1)結(jié)構域,兩者共同構成了NOB1蛋白的主要部分。PIN結(jié)構域包括大約100個氨基酸,位于NOB1基因的N端。NOB1蛋白主要是通過PIN結(jié)構域來結(jié)合前體rRNA,從而進一步促使核酸內(nèi)切酶在D位點裂開18SRNA的3'一末端,并使其成熟。23MRD1結(jié)構域位于NOB1蛋白的C端的第208到第296個氨基酸之間,其長約為90個氨基酸。目前的研究表明,NOB1是參與形成18S rRNA (ribosome RNA, rRNA) 的主要蛋白之一。更為重要的是,NOB1在26S蛋白酶體形成的過程中必不可少。而26S蛋白酶體是真核細胞內(nèi)大分子的三磷酸腺苷(adenosine triphosphoric acid, ATP)依賴性蛋白溶解復合體,是泛素-蛋白酶體途徑(ubiquity-proteasome pathway, UPP)的核心成分。UPP是細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解機制,主要由泛素(ubiquitin, Ub)、泛素活化酶(u biquitin-activatingenzyme, E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzymes, E2)、泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-proteinligases,E3)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(deubiquitinatingenzymes, DUB)等組成。UPP可以高效高選擇性的降解細胞內(nèi)某些具有生物活性的蛋白質(zhì),特別是對降解細胞周期調(diào)節(jié)蛋白具有重要作用,從而起到調(diào)控細胞周期的作用。由于NOB1的這些功能,其可能對細胞周期有重要的影響,因此,研究NOB1基因在腫瘤中的作用,對開發(fā)有效的治療肺癌的方法具有重要的參考價值。在本研究中,我們通過前期對非小細胞肺癌患者腫瘤組織樣品的分析,發(fā)現(xiàn)NOB1基因在腫瘤組織中高表達。由于NOB1基因在細胞周期的調(diào)控中具有重要作用,因此,我們進一步在細胞水平研究NOB1對肺癌細胞的影響及相應的分子機制,為NOB1在非小細胞肺癌的基礎研究和臨床治療研究提供一定的理論基礎。本研究一共分為三個部分進行,第一部分主要是研究NOB1在非小細胞肺癌組織中的表達情況；第二部分主要是研究NOB1對肺癌細胞的增殖的影響：第三部分主要是探討了NOB1影響肺癌細胞增殖的分子機制。一、NOB1在非小細胞腫瘤中的表達情況研究研究基因在腫瘤組織和相應的正常組織中的差異表達具有重要的意義。如果基因在正常組織中不表達,而在腫瘤組織中表達,那么這樣的基因就具有較為重要的研究價值,因為針對這種特異在腫瘤組織中表達的基因開發(fā)出的相應的靶向藥物的特異性就會較強,從而避免藥物在殺傷腫瘤細胞的同時,正常的組織細胞也被殺傷。在我們的研究中,我們首先就通過免疫組織化學技術確定NOB1基因在非小細胞肺癌以及正常組織中的表達情況,觀察NOB1基因是否在非小細胞肺癌組織中表達有差異。如果NOB1基因在非小細胞肺癌組織和正常組織中表達沒有差異,那么我們進一步研究NOB1基因在非小細胞肺癌中的作用將沒有太大的意義：如果NOB1基因基因在非小細胞肺癌組織和正常組織中表達具有差異,那么我們進一步研究NOB1基因在非小細胞肺癌中的作用具有重要的價值。我們的數(shù)據(jù)表明,NOB1基因確實是在非小細胞肺癌組織中高表達,并且陽性組織樣品比例高達93.1%。盡管在我們收集的29個非小細胞肺癌組織樣品中,還有6.9%的樣品呈現(xiàn)NOB1陰性表達,但是在非小細胞肺癌患者中,NON1陽性具有如此高的表達比例足以表明研究NOB1基因在非小細胞肺癌中具有重要價值,暗示NOB1基因可能在非小細胞肺癌中發(fā)揮著重要作用。二、NOB1影響肺癌細胞的增殖我們采用免疫組織化學技術發(fā)現(xiàn)NOB1基因在非小細胞肺癌組織中呈現(xiàn)出較為特異的高表達,因此,我們在接下來的這一部分研究中,進一步研究了NOB1對肺癌細胞增殖的影響。我們首先根據(jù)NOB1基因的mRNA農(nóng)達序列設計了能夠特異干擾NOB1基因的序列,合成序列之后通過分子克隆技術構建到慢病毒載體之中,然后包裝慢病毒并感染肺癌細胞系A549細胞以及H1299細胞。慢病毒介導的NOB 1基因的RNA干擾在腫瘤細胞中能夠持續(xù)地表達降解NOB1基因mRNA 的 shRNA (short-hairpin RNA),并且慢病毒對A549細胞以及H1299細胞的感染效率極高,能夠高效介導shRNA在肺癌腫瘤細胞中的表達,從而進步有效地沉默NOB1基因的表達。我們將慢病毒感染腫瘤細胞之后,利用qRT-PCR以及western-blot技術對沉默效率進行的鑒定,與我們的預期相符合,我們構建的shRNA慢病毒載體能夠有效地沉默NOB1基因的表達,為后續(xù)進步研究NOB1基因在肺癌細胞中的作用奠定了基礎。我們利用MTT實驗來檢測沉默NOB1基因之后,A549細胞以及H1299細胞這兩種肺癌細胞系的增殖狀況。MTT法是目前一種廣泛用來快速簡便測定細胞增殖的試劑。由于活細胞的線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠把MTT還原為甲瓚(Formazan),而甲瓚為藍紫色的結(jié)晶物質(zhì),不溶于水,所以就沉淀在活細胞中,但是死細胞因為沒有線粒體,故而不能還原MTT成為甲瓚。同時,二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)等有機溶劑能夠把細胞中的甲瓚溶解出來,然后用酶標儀在特定的波長處測定溶液的吸光度值,就能間接反映出細胞的多少。在我們的實驗研究中,利用MTT實驗發(fā)現(xiàn)抑制NOB1基因的表達之后,A549細胞以及H1299細胞這兩種肺癌細胞的增殖受到有效的抑制,并且隨著細胞培養(yǎng)時間的延長,細胞的增殖抑制就越明顯。腫瘤細胞分裂非常活躍,能夠不停地增殖,具有從單個細胞分裂形成一個克隆細胞團的能力。細胞的克隆形成實驗也是最常用來檢測細胞增殖的一個重要方法。因此,在我們的研究中,還利用了細胞克隆形成實驗來進一步驗證NOB1基因沉默對腫瘤細胞的增殖抑制效應。我們首先檢測了NOB1基因沉默之后,細胞克隆形態(tài)的大小,發(fā)現(xiàn)實驗組即NOB1基因沉默組的腫瘤細胞克隆明顯小于對照組。同時,我們進一步統(tǒng)計各組的細胞克隆數(shù)目也表明NOB1基因沉默組能夠抑制腫瘤細胞克隆的形成,實驗組的幾乎沒有細胞克隆,而對照組有大量的細胞克隆形成。進一步有力地證明了干擾NOB1基因之后,腫瘤細胞的增殖受到有效地抑制。這為進一步研究NOB1基因以及臨床上針對NOB1基因做深入地開展治療方法研究提供了基礎研究價值和參考。我們的研究工作有力地證明了沉默NOB1基因之后能夠有效地控制腫瘤細胞的增殖,并且在非小細胞肺癌組織中也發(fā)現(xiàn)NOB1基因具有較為特異的高表達,因此具有重要的臨床應用價值。然而,我們只在兩株肺癌細胞系A549和H1299細胞系中進行了實驗。另外,體內(nèi)的細胞微環(huán)境更加復雜,抑制NOB1基因能夠是否能夠控制肺癌的生長還需要在后續(xù)的實驗中進一步進行動物體內(nèi)實驗。三、NOB1抑制肺癌腫瘤細胞增殖的機制研究由于NOB1基因沉默之后,細胞的增殖受到抑制,提示NO B1基因能夠影響細胞周期。因此,我們對正常的A549細胞系、感染對照慢病毒的A549細胞以及感染NOB1-shRNA1慢病毒的A549細胞系的細胞周期進行研究。我們利用流式細胞術的方法來檢測各組細胞的細胞周期。對流式數(shù)據(jù)進行進一步統(tǒng)計處理發(fā)現(xiàn)通過慢病毒介導的RNA干擾掉NOB1基因之后,A549肺癌細胞系的周期被阻滯在G0/G1期。實驗組即感染NOB1-shRNA慢病毒的A549細胞這一組處于G0/G1期的細胞明顯多于其他兩組。感染NOB1-shRNA慢病毒的A549細胞組處于G0/G1期的細胞比例為69.32±0.45%,而正常A549細胞組為57.05±0.37%,感染對照慢病毒的A549細胞組這一比例為59.21±0.86%。同時,在感染NOB1-shRNA慢病毒的A549細胞這一組中,處于S期和G2/M期的細胞明顯要少于正常A549細胞組和感染對照慢病毒的A549細胞組,進一步驗證了NOB1基因被沉默之后,腫瘤細胞被阻滯在了G0/G1期我們收集正常的A549細胞系、感染對照慢病毒的A549細胞以及感染NOB1-shRNA慢病毒的A549細胞系這三組的細胞通過western-blot檢測細胞周期相關基因CDK4、Cyclin D1、CDKN2A以及CDKN2B的表達。我們的數(shù)據(jù)表明,沉默NOB1基因之后,在感染NOB1-shRNA慢病毒的A549細胞中CDK4和Cyclin D1表達均下降,而CDKN2A以及CDKN2B的表達在這三組細胞中沒有變化,表明NOB1通過下調(diào)細胞周期蛋白CDK4以及Cyclin D1來調(diào)控肺癌細胞的增殖。
[Abstract]:Lung cancer is one of the largest causes of death in the world . According to the latest statistical studies , lung cancer is the highest among men with the highest mortality rate . In addition , according to the relevant authoritative statistics , the incidence and mortality of lung cancer in China accounted for 22 . 7 % of the total cancer deaths in 2008 . Non - small cell lung carcinoma ( NSCLC ) is a kind of lung cancer characterized by rapid growth , early metastasis and high invasion . This study shows that NOB1 plays an important role in the regulation of cell cycle .
The expression of NOB1 gene in non - small cell lung cancer was studied . The results showed that NOB1 gene was highly expressed in non - small cell lung cancer . In our study , the proliferation of tumor cells was significantly inhibited after the NOB1 gene silencing , and it was found that NOB1 gene silencing group could inhibit the proliferation of tumor cells .

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【共引文獻】

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本文編號：1817954