本文選題：NOB1 + 非小細(xì)胞肺癌��； 參考：《山東大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：肺癌是世界上引起死亡最多的癌癥之一。據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)研究表明,肺癌是在男性中致死率最高的癌癥,而在女性中,尤其是發(fā)展中國家的女性中,其致死率也非常高。另外根據(jù)相關(guān)權(quán)威統(tǒng)計(jì),2008年我國肺癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤第1位,發(fā)病率達(dá)57個(gè)/10萬,死亡率為46個(gè)/10萬,并且肺癌死亡的病人約占國內(nèi)癌癥死亡總?cè)藬?shù)的22.7%。因此,研究肺癌的發(fā)病機(jī)制以及治療手段非常急迫,對(duì)延長患者的生存率具有重要的意義。肺癌主要包括小細(xì)胞肺癌(small-cell lung carcinoma, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma, NSCLC)。其中,SCLC約占肺癌總數(shù)的20%,NSCLC約占肺癌總數(shù)的80%。小細(xì)胞肺癌是一種以生長迅速、早期轉(zhuǎn)移、高度侵襲性為特點(diǎn)的肺癌類型。非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma, NSCLC)主要包括鱗狀細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinoma)、腺癌(lung adenocarcinoma)和大細(xì)胞癌(pulmonary large cell carcinoma)三種。與小細(xì)胞癌相比,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長分裂較慢,轉(zhuǎn)移擴(kuò)散相對(duì)較晚,因此惡性程度較低。盡管如此,由于約75%的患者被發(fā)現(xiàn)患病時(shí)已處于中晚期,癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移,難以根治,因此5年生存率仍然很低。由于非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的大多數(shù),因此,亟待開發(fā)有效的治療非小細(xì)胞肺癌的方法。人類的NOB 1 (Nin1/RPN12-binding Protein1, NOB1)基因定位于染色體的16q22.1,包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子,其cDNA全長為1749bp,包含一個(gè)開放閱讀框,有1271bp長,編碼412個(gè)氨基酸序列的蛋白,分子量46kDa。NOB1蛋白具有兩個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域,即位于NOB1蛋白N端的PIN(Pi1Taminoterminus, PIN)結(jié)構(gòu)域和位于其C端的ZNRD1 (zinc ribbon domain containing 1,ZNRD1)結(jié)構(gòu)域,兩者共同構(gòu)成了NOB1蛋白的主要部分。PIN結(jié)構(gòu)域包括大約100個(gè)氨基酸,位于NOB1基因的N端。NOB1蛋白主要是通過PIN結(jié)構(gòu)域來結(jié)合前體rRNA,從而進(jìn)一步促使核酸內(nèi)切酶在D位點(diǎn)裂開18SRNA的3'一末端,并使其成熟。23MRD1結(jié)構(gòu)域位于NOB1蛋白的C端的第208到第296個(gè)氨基酸之間,其長約為90個(gè)氨基酸。目前的研究表明,NOB1是參與形成18S rRNA (ribosome RNA, rRNA) 的主要蛋白之一。更為重要的是,NOB1在26S蛋白酶體形成的過程中必不可少。而26S蛋白酶體是真核細(xì)胞內(nèi)大分子的三磷酸腺苷(adenosine triphosphoric acid, ATP)依賴性蛋白溶解復(fù)合體,是泛素-蛋白酶體途徑(ubiquity-proteasome pathway, UPP)的核心成分。UPP是細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解機(jī)制,主要由泛素(ubiquitin, Ub)、泛素活化酶(u biquitin-activatingenzyme, E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzymes, E2)、泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-proteinligases,E3)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(deubiquitinatingenzymes, DUB)等組成。UPP可以高效高選擇性的降解細(xì)胞內(nèi)某些具有生物活性的蛋白質(zhì),特別是對(duì)降解細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白具有重要作用,從而起到調(diào)控細(xì)胞周期的作用。由于NOB1的這些功能,其可能對(duì)細(xì)胞周期有重要的影響,因此,研究NOB1基因在腫瘤中的作用,對(duì)開發(fā)有效的治療肺癌的方法具有重要的參考價(jià)值。在本研究中,我們通過前期對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織樣品的分析,發(fā)現(xiàn)NOB1基因在腫瘤組織中高表達(dá)。由于NOB1基因在細(xì)胞周期的調(diào)控中具有重要作用,因此,我們進(jìn)一步在細(xì)胞水平研究NOB1對(duì)肺癌細(xì)胞的影響及相應(yīng)的分子機(jī)制,為NOB1在非小細(xì)胞肺癌的基礎(chǔ)研究和臨床治療研究提供一定的理論基礎(chǔ)。本研究一共分為三個(gè)部分進(jìn)行,第一部分主要是研究NOB1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況；第二部分主要是研究NOB1對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖的影響：第三部分主要是探討了NOB1影響肺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。一、NOB1在非小細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)情況研究研究基因在腫瘤組織和相應(yīng)的正常組織中的差異表達(dá)具有重要的意義。如果基因在正常組織中不表達(dá),而在腫瘤組織中表達(dá),那么這樣的基因就具有較為重要的研究價(jià)值,因?yàn)獒槍?duì)這種特異在腫瘤組織中表達(dá)的基因開發(fā)出的相應(yīng)的靶向藥物的特異性就會(huì)較強(qiáng),從而避免藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí),正常的組織細(xì)胞也被殺傷。在我們的研究中,我們首先就通過免疫組織化學(xué)技術(shù)確定NOB1基因在非小細(xì)胞肺癌以及正常組織中的表達(dá)情況,觀察NOB1基因是否在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)有差異。如果NOB1基因在非小細(xì)胞肺癌組織和正常組織中表達(dá)沒有差異,那么我們進(jìn)一步研究NOB1基因在非小細(xì)胞肺癌中的作用將沒有太大的意義：如果NOB1基因基因在非小細(xì)胞肺癌組織和正常組織中表達(dá)具有差異,那么我們進(jìn)一步研究NOB1基因在非小細(xì)胞肺癌中的作用具有重要的價(jià)值。我們的數(shù)據(jù)表明,NOB1基因確實(shí)是在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá),并且陽性組織樣品比例高達(dá)93.1%。盡管在我們收集的29個(gè)非小細(xì)胞肺癌組織樣品中,還有6.9%的樣品呈現(xiàn)NOB1陰性表達(dá),但是在非小細(xì)胞肺癌患者中,NON1陽性具有如此高的表達(dá)比例足以表明研究NOB1基因在非小細(xì)胞肺癌中具有重要價(jià)值,暗示NOB1基因可能在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮著重要作用。二、NOB1影響肺癌細(xì)胞的增殖我們采用免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)NOB1基因在非小細(xì)胞肺癌組織中呈現(xiàn)出較為特異的高表達(dá),因此,我們?cè)诮酉聛淼倪@一部分研究中,進(jìn)一步研究了NOB1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響。我們首先根據(jù)NOB1基因的mRNA農(nóng)達(dá)序列設(shè)計(jì)了能夠特異干擾NOB1基因的序列,合成序列之后通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建到慢病毒載體之中,然后包裝慢病毒并感染肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞以及H1299細(xì)胞。慢病毒介導(dǎo)的NOB 1基因的RNA干擾在腫瘤細(xì)胞中能夠持續(xù)地表達(dá)降解NOB1基因mRNA 的 shRNA (short-hairpin RNA),并且慢病毒對(duì)A549細(xì)胞以及H1299細(xì)胞的感染效率極高,能夠高效介導(dǎo)shRNA在肺癌腫瘤細(xì)胞中的表達(dá),從而進(jìn)步有效地沉默NOB1基因的表達(dá)。我們將慢病毒感染腫瘤細(xì)胞之后,利用qRT-PCR以及western-blot技術(shù)對(duì)沉默效率進(jìn)行的鑒定,與我們的預(yù)期相符合,我們構(gòu)建的shRNA慢病毒載體能夠有效地沉默NOB1基因的表達(dá),為后續(xù)進(jìn)步研究NOB1基因在肺癌細(xì)胞中的作用奠定了基礎(chǔ)。我們利用MTT實(shí)驗(yàn)來檢測沉默NOB1基因之后,A549細(xì)胞以及H1299細(xì)胞這兩種肺癌細(xì)胞系的增殖狀況。MTT法是目前一種廣泛用來快速簡便測定細(xì)胞增殖的試劑。由于活細(xì)胞的線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠把MTT還原為甲瓚(Formazan),而甲瓚為藍(lán)紫色的結(jié)晶物質(zhì),不溶于水,所以就沉淀在活細(xì)胞中,但是死細(xì)胞因?yàn)闆]有線粒體,故而不能還原MTT成為甲瓚。同時(shí),二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)等有機(jī)溶劑能夠把細(xì)胞中的甲瓚溶解出來,然后用酶標(biāo)儀在特定的波長處測定溶液的吸光度值,就能間接反映出細(xì)胞的多少。在我們的實(shí)驗(yàn)研究中,利用MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制NOB1基因的表達(dá)之后,A549細(xì)胞以及H1299細(xì)胞這兩種肺癌細(xì)胞的增殖受到有效的抑制,并且隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞的增殖抑制就越明顯。腫瘤細(xì)胞分裂非�；钴S,能夠不停地增殖,具有從單個(gè)細(xì)胞分裂形成一個(gè)克隆細(xì)胞團(tuán)的能力。細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)也是最常用來檢測細(xì)胞增殖的一個(gè)重要方法。因此,在我們的研究中,還利用了細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證NOB1基因沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)。我們首先檢測了NOB1基因沉默之后,細(xì)胞克隆形態(tài)的大小,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組即NOB1基因沉默組的腫瘤細(xì)胞克隆明顯小于對(duì)照組。同時(shí),我們進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)各組的細(xì)胞克隆數(shù)目也表明NOB1基因沉默組能夠抑制腫瘤細(xì)胞克隆的形成,實(shí)驗(yàn)組的幾乎沒有細(xì)胞克隆,而對(duì)照組有大量的細(xì)胞克隆形成。進(jìn)一步有力地證明了干擾NOB1基因之后,腫瘤細(xì)胞的增殖受到有效地抑制。這為進(jìn)一步研究NOB1基因以及臨床上針對(duì)NOB1基因做深入地開展治療方法研究提供了基礎(chǔ)研究價(jià)值和參考。我們的研究工作有力地證明了沉默NOB1基因之后能夠有效地控制腫瘤細(xì)胞的增殖,并且在非小細(xì)胞肺癌組織中也發(fā)現(xiàn)NOB1基因具有較為特異的高表達(dá),因此具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。然而,我們只在兩株肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299細(xì)胞系中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。另外,體內(nèi)的細(xì)胞微環(huán)境更加復(fù)雜,抑制NOB1基因能夠是否能夠控制肺癌的生長還需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。三、NOB1抑制肺癌腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制研究由于NOB1基因沉默之后,細(xì)胞的增殖受到抑制,提示NO B1基因能夠影響細(xì)胞周期。因此,我們對(duì)正常的A549細(xì)胞系、感染對(duì)照慢病毒的A549細(xì)胞以及感染NOB1-shRNA1慢病毒的A549細(xì)胞系的細(xì)胞周期進(jìn)行研究。我們利用流式細(xì)胞術(shù)的方法來檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)處理發(fā)現(xiàn)通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾掉NOB1基因之后,A549肺癌細(xì)胞系的周期被阻滯在G0/G1期。實(shí)驗(yàn)組即感染NOB1-shRNA慢病毒的A549細(xì)胞這一組處于G0/G1期的細(xì)胞明顯多于其他兩組。感染NOB1-shRNA慢病毒的A549細(xì)胞組處于G0/G1期的細(xì)胞比例為69.32±0.45%,而正常A549細(xì)胞組為57.05±0.37%,感染對(duì)照慢病毒的A549細(xì)胞組這一比例為59.21±0.86%。同時(shí),在感染NOB1-shRNA慢病毒的A549細(xì)胞這一組中,處于S期和G2/M期的細(xì)胞明顯要少于正常A549細(xì)胞組和感染對(duì)照慢病毒的A549細(xì)胞組,進(jìn)一步驗(yàn)證了NOB1基因被沉默之后,腫瘤細(xì)胞被阻滯在了G0/G1期我們收集正常的A549細(xì)胞系、感染對(duì)照慢病毒的A549細(xì)胞以及感染NOB1-shRNA慢病毒的A549細(xì)胞系這三組的細(xì)胞通過western-blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK4、Cyclin D1、CDKN2A以及CDKN2B的表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)表明,沉默NOB1基因之后,在感染NOB1-shRNA慢病毒的A549細(xì)胞中CDK4和Cyclin D1表達(dá)均下降,而CDKN2A以及CDKN2B的表達(dá)在這三組細(xì)胞中沒有變化,表明NOB1通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白CDK4以及Cyclin D1來調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖。
[Abstract]:Lung cancer is one of the largest causes of death in the world . According to the latest statistical studies , lung cancer is the highest among men with the highest mortality rate . In addition , according to the relevant authoritative statistics , the incidence and mortality of lung cancer in China accounted for 22 . 7 % of the total cancer deaths in 2008 . Non - small cell lung carcinoma ( NSCLC ) is a kind of lung cancer characterized by rapid growth , early metastasis and high invasion . This study shows that NOB1 plays an important role in the regulation of cell cycle .
The expression of NOB1 gene in non - small cell lung cancer was studied . The results showed that NOB1 gene was highly expressed in non - small cell lung cancer . In our study , the proliferation of tumor cells was significantly inhibited after the NOB1 gene silencing , and it was found that NOB1 gene silencing group could inhibit the proliferation of tumor cells .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1817954