本文選題：IDH2 + 野生型��； 參考：《浙江理工大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase,IDH)是一類在三羧酸循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶家族。人類基因組有5種IDH基因,可編碼生成三種異檸檬酸脫氫酶(IDH1、IDH2及IDH3),其中IDH2位于線粒體,催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸(α-KG)和NADPH。已有研究表明在不同腫瘤中存在各種IDH突變體,包括急性髓細(xì)胞白血病(AML)、腦腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等,其最為常見的突變堿基位于R132(IDH1)、R140與R172(IDH2)。IDH突變體將α-KG轉(zhuǎn)化生成腫瘤代謝物2-羥戊二酸(2-HG),從而紊亂了一系列α-KG依賴性雙加氧酶反應(yīng)。具體表現(xiàn)為:促進(jìn)組蛋白賴氨酸甲基化;抑制10-11易位酶家族(TET)羥甲基化,進(jìn)而激活CpG島的DNA甲基化;穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達(dá),上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。目前與癌癥發(fā)生和增殖密切相關(guān)的IDH2突變體的結(jié)構(gòu)、功能及穩(wěn)定性的研究鮮有報(bào)道,本課題通過分析不同突變體的IDH2結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)定性,將對(duì)深入理解IDH2突變導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、增殖的分子機(jī)制及其診療提供一些線索和參考。本研究選用哺乳細(xì)胞表達(dá)載體pCMV6-AC-Myc-His,通過基因克隆、重疊PCR、雙酶切鑒定與測(cè)序成功構(gòu)建11個(gè)IDH2重組表達(dá)載體:WT、R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P。在此基礎(chǔ)上,在293T與小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)IDH2野生型與不同突變體,檢測(cè)蛋白表達(dá)與相關(guān)信號(hào)通路(Western)、細(xì)胞代謝(檢測(cè)酶活力、葡萄糖及乳酸、ROS變化)、蛋白降解(Western)、蛋白質(zhì)與熱激蛋白90相互作用(免疫共沉淀)等實(shí)驗(yàn),通過生物信息學(xué)同源模型構(gòu)建,分析突變對(duì)IDH2結(jié)構(gòu)的影響,并與藥物導(dǎo)致蛋白降解的結(jié)果進(jìn)行相互驗(yàn)證與比對(duì),探究IDH2野生型和突變體之間結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)定性的差異。結(jié)果表明:1)野生型與突變體R140/R172在293T和BV2細(xì)胞中表達(dá)水平具有明顯差異;2)突變體IDH2酶活力顯著低于野生型;3)在293T細(xì)胞中,與野生型IDH2相比較,R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突變體過表達(dá)降低細(xì)胞乳酸含量,R172S、R172K、R172W、R172G突變體過表達(dá)導(dǎo)致葡萄糖含量升高,R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C突變體ROS含量均顯著降低;不同突變體的過表達(dá)對(duì)細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路影響不同,其中多個(gè)突變體過表達(dá)抑制pAKT和pS6的表達(dá),并導(dǎo)致Cyclin D1表達(dá)下調(diào);這些結(jié)果表明突變體IDH2過表達(dá)減緩了細(xì)胞代謝與生長(zhǎng)。而在BV2細(xì)胞中,過表達(dá)R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突變體增加了TNF-α表達(dá);其中R172S、R172M、R172W、R172G突變體過表達(dá)誘導(dǎo)IL-6表達(dá),推測(cè)這些突變體的過表達(dá)可能與炎癥反應(yīng)的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián);4)泛素化蛋白連接酶抑制劑Bortezomib對(duì)野生型IDH2表達(dá)無影響,而對(duì)突變體R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K表達(dá)敏感,促使其蛋白降解;對(duì)過表達(dá)的突變體R172M、R172W、R172G、R172C、R172P具有耐藥性,藥物處理過后的表達(dá)水平并沒有發(fā)生明顯變化。同源模建結(jié)構(gòu)分析表明相應(yīng)的點(diǎn)突變影響了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。HSP90抑制劑17-AAG對(duì)突變體IDH2過表達(dá)并無影響,免疫共沉淀結(jié)果表明HSP90與IDH2無相互作用。以上研究將可能為IDH2作為標(biāo)靶提供一些重要的信息與理論依據(jù)。
[Abstract]:Isocitrate dehydrogenase (IDH) is a family of enzymes that play a key role in the three carboxylic acid cycle. There are 5 IDH genes in the human genome, which can encode three ISO citrate dehydrogenases (IDH1, IDH2 and IDH3), in which IDH2 is located in the mitochondria and catalyzes the oxidation of ISO decarboxylic acid to produce alpha ketopurate (alpha -KG) and NADPH.. A variety of IDH mutants have been found in different tumors, including acute myelocytic leukemia (AML), brain tumor and glioma. The most common mutation base is located in R132 (IDH1), and R140 and R172 (IDH2).IDH mutants transform alpha -KG into tumor metabolite 2- hydroxyl diacid (2-HG), thereby disorder a series of alpha -KG dependence. The reaction of dioxygenase is specific: promoting the methylation of protein lysine, inhibiting the methylation of the 10-11 translocation enzyme family (TET), activating the DNA methylation of CpG Island, stabilizing the expression of HIF-1 alpha (HIF-1 alpha) and up regulating the vascular endothelial growth factor (VEGF). The structure of the IDH2 mutant, which is closely related to the occurrence and proliferation of cancer, is present. The study of energy and stability is rarely reported. By analyzing the IDH2 structure, function and stability of different mutants, this topic will provide some clues and references for the understanding of the molecular mechanism and diagnosis and treatment of IDH2 mutation leading to tumor occurrence and proliferation. This study selects mammalian cell expression vector pCMV6-AC-Myc-His, and reduplication of PCR through gene cloning. 11 IDH2 recombinant vectors were successfully constructed by double enzyme digestion and sequencing: WT, R140G, R140Q, R140W, R172S, R172K, R172M, R172W, R172G, R172C, and transiently transfected with mouse microglia to express wild and different mutant bodies, detect protein expression and related signaling pathways, and cell metabolism Enzyme activity, glucose and lactic acid, ROS change), protein degradation (Western), protein and heat shock protein 90 interaction (immunoprecipitation) and other experiments, constructed by bioinformatics homologous model, analyze the effect of mutation on the structure of IDH2, and verify and compare with the results of drug induced protein degradation and explore the wild type and process of IDH2. The difference between the structure, function and stability of the variant. The results showed that: 1) the expression level of the wild type and the mutant R140/R172 in the 293T and BV2 cells was significantly different; 2) the activity of the mutant IDH2 enzyme was significantly lower than that of the wild type; 3) in 293T cells, the R172S, R172K, R172M, R172W, R172G, R172C, mutants were overexpressed in comparison with the wild type IDH2. The over expression of low cell lactic acid, R172S, R172K, R172W, R172G led to the increase of glucose content, and the content of R140G, R140Q, R140W, R172S, R172K, R172M, R172W, R172G, and mutant were significantly reduced, and the over expression of the mutants had different effects on the signaling pathway. The results showed that the expression of Cyclin D1 was down regulated, and the results showed that the overexpression of the mutant IDH2 slowed down the cell metabolism and growth. In BV2 cells, the overexpression of R140Q, R140W, R172S, R172K, R172M, R172W, R172G, R172C, mutants induced the expression of alpha. The overexpression of some mutants may be associated with the occurrence of inflammatory reactions; 4) ubiquitin protein ligase inhibitor Bortezomib has no effect on the expression of wild type IDH2, but is sensitive to the expression of mutant R140G, R140Q, R140W, R172S, R172K, and promotes its protein degradation; the mutant R172M, R172W, R172G, R172C, R172P has resistance, The expression level after treatment did not change significantly. Homologous model construction analysis showed that the corresponding point mutation affected the protein structure.HSP90 inhibitor 17-AAG on the overexpression of the mutant IDH2, and the immunoprecipitation results showed that there was no interaction between HSP90 and IDH2. The above study would provide a target for IDH2 as a target. Some important information and theoretical basis.

【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：1809078