本文選題：腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液 + 微環(huán)境��； 參考：《河南大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：腫瘤的發(fā)生和發(fā)展必須有充足的營(yíng)養(yǎng)供給,一般認(rèn)為腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給依賴于新生血管形成。然而,眾所周知腫瘤新生血管具有畸形高通透性的特點(diǎn),這種畸形新生血管很難完成充足的營(yíng)養(yǎng)供給,臨床上抗新生血管形成“餓死”腫瘤的療法不僅沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果,甚至使腫瘤更加惡化的現(xiàn)象也證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。相反,腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液因含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和細(xì)胞生長(zhǎng)因子,恰好能夠沐浴和支持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),有可能是腫瘤發(fā)展的直接和主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,因此對(duì)腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液促癌作用的認(rèn)識(shí)是腫瘤防治成功的關(guān)鍵。本研究以肺癌為研究對(duì)象探索腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液微環(huán)境促進(jìn)肺癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制以及相關(guān)的藥物治療,以期為肺癌防治提供有效的措施和方法。本研究首先從腫瘤組織中分離腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液并進(jìn)行蛋白定量得到10μg蛋白質(zhì)/毫升的腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液用于體內(nèi)和體外試驗(yàn)。體外試驗(yàn)我們用腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液處理LLC細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Nanog和PCNA的表達(dá),軟瓊脂克隆形成和細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞自我更新,MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲,AO/EB熒光雙染法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡。接著,我們采用氣管滴注方式建立了小鼠原位肺癌共移植模型,通過(guò)免疫組化和Western Blot檢測(cè)肺癌小鼠肺組織中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog,細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA,細(xì)胞水運(yùn)載標(biāo)志物水通道蛋白1,新生血管形成標(biāo)志物CD31,低氧標(biāo)志物低氧誘導(dǎo)因子HIF-1和碳酸酐酶IX,及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物N-cadherin、E-cadherin、Vimentin和Cytokeratin 18表達(dá);同時(shí),用伊文斯蘭通透性和干濕重法檢測(cè)肺癌小鼠肺組織血管通透性和肺組織含水量;用ELISA試劑盒檢測(cè)肺癌小鼠血清中血管紊亂標(biāo)志物5-HIAA,糖酵解標(biāo)志物ROS、Lactate和Pyruvate,炎癥標(biāo)志物8-OHdG、TNF-α和hs-CRR。另外,我們用新生血管形成抑制劑Vadimezan、抗炎藥物地塞米松、Na-K-ATP酶抑制劑地高辛、以及醛固酮受體阻斷劑螺內(nèi)酯治療腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液共移植肺癌小鼠,觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液形成、新生血管形成、血管通透性及腫瘤生長(zhǎng)的影響。體外試驗(yàn)結(jié)果表明,腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液處理后的LLC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Nanog和PCNA的表達(dá)增加,腫瘤細(xì)胞軟瓊脂克隆和細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)的克隆數(shù)增多,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化增加,饑餓誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡減少。小鼠原位癌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液與腫瘤細(xì)胞共移植后小鼠肺癌發(fā)生率升高,肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)增多,肺組織血管通透性增強(qiáng),肺組織含水量增加;肺組織腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog,細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA,細(xì)胞水運(yùn)載標(biāo)志物水通道蛋白1,低氧標(biāo)志物低氧誘導(dǎo)因子HIF-1和碳酸酐酶IX,及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高,E-cadherin和Cytokeratin18表達(dá)降低;炎癥標(biāo)志物、糖酵解標(biāo)志物和氧化損傷標(biāo)志物水平升高;新生血管形成標(biāo)志物CD31的表達(dá)沒(méi)有顯著變化。有趣的是,炎癥反應(yīng)抑制劑地塞米松、Na-K-ATP酶抑制劑地高辛和醛固酮受體阻斷劑螺內(nèi)酯能夠降低腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生率,減少肺癌小鼠肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù),增加新生血管形成標(biāo)志物CD31表達(dá)但降低血清中血管紊亂標(biāo)志物5-HIAA水平;新生血管形成抑制劑Vadimezan雖然降低新生血管形成標(biāo)志物CD31表達(dá),卻增加血清中5-HIAA水平,提高肺癌發(fā)生率,增加肺癌小鼠肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù);另外,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤組織含水量升高時(shí)組織中5-HIAA和水通道蛋白1的表達(dá)增加,但是組織中CD31的表達(dá)無(wú)明顯變化。綜上所述,腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液能夠促進(jìn)小鼠肺癌發(fā)生和發(fā)展,其促肺癌作用與腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液誘導(dǎo)小鼠肺組織低氧微環(huán)境、糖酵解代謝、炎癥反應(yīng)和新生血管紊亂有密切聯(lián)系,與正常新生血管形成無(wú)關(guān)。
[Abstract]:The occurrence and development of tumor must be provided with sufficient nutrition. It is generally believed that the nutritional supply of tumor depends on the formation of neovascularization. However, it is known that the neovascular neovascularization is characterized by high permeability, which is difficult to complete the sufficient nutrient supply and is clinically resistant to the formation of "starving" tumor. Not only does the method fail to achieve the desired effect, even the worsening of the tumor confirms this view. On the contrary, the tumor cell interstitial fluid, which is able to bathe and support tumor cell growth because of its rich nutrition and cell growth factors, may be the direct and main source of tumor development and therefore to the tumor cells. The understanding of the role of fluid promoting cancer is the key to the success of cancer prevention and control. This study aims to explore the mechanism of tumor cell interstitial fluid microenvironment to promote the occurrence and development of lung cancer and the related drug treatment, so as to provide effective measures and methods for the prevention and treatment of lung cancer. In vitro and in vitro, 10 g / ml of tumor cell fluid was used in vivo and in vitro. In vitro, we used tumor cell fluid to treat LLC cells. Flow cytometry was used to detect the expression of tumor stem cell markers CD133, Nanog and PCNA, soft agar Kuron formation and cell formation test for detection of tumor cells Self renewal, MTT assay was used to detect tumor cell proliferation, immunofluorescence technique was used to detect epithelial mesenchymal transition of tumor cells, cell scratch test was used to detect tumor cell migration, Transwell test was used to detect tumor cell invasion, and AO/EB fluorescence double staining method was used to detect autophagy and apoptosis of tumor cells. Cancer stem cell markers Nanog, cell proliferation marker PCNA, water channel protein 1, neovascularization marker CD31, hypoxia inducible hypoxia inducible factor HIF-1 and carbonic anhydrase IX, and N- of epithelial mesenchymal transition marker, were detected by immunohistochemistry and Western Blot in lung cancer mice. Cadherin, E-cadherin, Vimentin and Cytokeratin 18 were expressed, and the permeability of lung tissue and the water content of lung tissue in lung cancer mice were detected by Evans permeability and dry wet weight method. The blood vessel disorder markers in the serum of lung cancer mice were detected by ELISA kit 5-HIAA, the glycolysis markers ROS, Lactate and Pyruvate, and the inflammatory markers 8-OHdG, TN. F- alpha and hs-CRR., we used neovascularization as inhibitor Vadimezan, antiinflammatory drug dexamethasone, Na-K-ATP enzyme inhibitor digoxin, and aldosterone blocker spironolactone in the treatment of tumor cell interstitial lung cancer mice, and observed the formation of interstitial fluid, angiogenesis, vascular permeability and tumor growth of tumor cells. In vitro test results showed that the expression of LLC cell tumor stem cell markers CD133, Nanog and PCNA increased, the number of clones in the soft agar cloning and cell formation of tumor cells increased, the transformation of epithelial mesenchymal transition increased, and the autophagy and apoptosis of the swell cells induced by starvation were reduced. The results showed that the incidence of lung cancer in the tumor cells was increased, the number of lung nodules increased, the permeability of the lung tissue increased, the water content of the lung increased, the marker of the lung cancer stem cell Nanog, the marker of cell proliferation PCNA, the water channel protein 1 of the cell water carrier, the low oxygen marker The expression of oxygen inducible factor HIF-1 and carbonic anhydrase IX, and the expression of epithelial mesenchymal transition markers N-cadherin and Vimentin increased, the expression of E-cadherin and Cytokeratin18 decreased; inflammatory markers, glycolytic markers and oxidative damage markers increased; the expression of CD31 in the neovascularization marker did not change significantly. Interestingly, the inflammatory reaction was suppressed. Preparation of dexamethasone, Na-K-ATP inhibitor, digoxin and aldosterone blocker, spironolactone can reduce the incidence of lung cancer induced by tumor cell interstitial fluid, decrease the number of lung tumor nodules in lung cancer mice, increase the expression of neovascularization marker CD31, but reduce the level of 5-HIAA in blood vessel disorder markers, and inhibit the formation of neovascularization. Although the preparation of Vadimezan decreased the expression of the neovascularization marker CD31, it increased the level of 5-HIAA in the serum, increased the incidence of lung cancer and increased the number of lung tumor nodules in lung cancer mice. In addition, we found that the expression of 5-HIAA and aquaporin 1 increased in the tissue when the water content was elevated, but the expression of CD31 in the tissue was not significantly changed. In summary, the interstitial fluid of tumor cells can promote the development and development of lung cancer in mice. The role of lung cancer is closely related to the hypoxia microenvironment, glycolytic metabolism, inflammatory reaction and neovascular disorder induced by tumor cell interstitial fluid, and is not related to the formation of normal neovascularization.

【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：1802249