本文選題：ERCC1 + mRNA　； 參考：《吉林大學》2015年博士論文

【摘要】：肺癌在全球范圍內是致死率最高的惡性腫瘤（InternationalAgency for Research on Cancer, IARC， http://www.iarc.fr）。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌病理類型中最常見的肺癌，占所有肺癌病例70%以上（IARC，2008）。據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO最新調查，肺癌的年齡標準化發(fā)病率為33.5例／100，000人，在男性中為45.9例／100，000人，明顯高于女性21.3例／100，000人。雖然傳統(tǒng)外科等治療手段的日益進步已經極大地改善了肺癌患者的預后及生存質量，但由于目前對肺癌發(fā)病的分子機制缺乏深入的認識，因此現(xiàn)有的早期診斷靶標及抗癌治療對肺癌患者的作用也顯得非常有限。據(jù)報道，在首次就診的非小細胞肺癌患者中，超過50％的病例已進展為III期或已出現(xiàn)轉移，失去手術治療的機會。而最近，鉑類為基礎的聯(lián)合化療方案被認為是治療晚期非小細胞肺癌最有效的方法之一。然而，腫瘤是高度異質性疾病，即便處于同樣臨床分期或病理類型相同的肺癌患者，對鉑類化療藥物的敏感性往往呈顯著差異。 目前學界普遍認為非小細胞肺癌的基因型差異與機體對鉑類為基礎的化療藥物的敏感性具有一定的相關性。鉑類化療藥物，如順鉑及卡鉑是目前抗癌化療藥物中應用最為普及，療效最為明確的抗癌藥物之一，具有較強的細胞毒性。鉑類藥物進入細胞核后與核內DNA結合，通過形成鉑-DNA絡合物，導致DNA不可逆性損傷，并誘導細胞發(fā)生凋亡(apoptosis)，從而發(fā)揮其抗癌作用。由于細胞內存在DNA損傷修復機制，鉑類化療藥物造成的DNA損傷部分可由細胞通過募集DNA損傷修復相關因子進行修復，因此DNA修復過程中調控因子的表達及其功能被認為在腫瘤對鉑類化療藥物的敏感性起著重要的決定作用。這些分子的表達及其功能的異常激活，可以通過增強腫瘤細胞對鉑類化療藥物的耐受性，影響鉑類化療藥物在非小細胞肺癌患者中應用療效。核苷酸切除修復機制（NER）是DNA修復途徑中最為主要的途徑之一，可以切除修復順鉑誘導及UV輻照產生的DNA損傷。目前人們已發(fā)現(xiàn)20余種參與NER修復途徑的酶蛋白，可以特異性識別DNA損傷片段，通過協(xié)同作用共同完成DNA損傷修復過程。切除修復交叉互補基因1-ERCC1便是其中最為關鍵的限速酶，，與XPF共同負責催化基因5’端切口，NER途徑中起著重要的作用。核糖核苷酸還原酶M1亞基基因（RRM1）在人類基因組中位于染色體11p15.5位點，其編碼蛋白負責催化脫氧核糖核苷酸的生物合成，在DNA合成中起著重要的調控作用。 以往的研究表明，ERCC1和RRM1在非小細胞肺癌患者中與鉑類抗癌化療藥物的敏感性密切相關，并有可能影響非小細胞肺癌化療后預后。Kotoula等人，2012; Leng等人，2012。但迄今為止，ERCC1與RRM1分別在非小細胞肺癌鉑類抗癌治療敏感性及其他臨床相關指標的研究尚未見報道。尤其是ERCC1和RRM1兩個基因之間的聯(lián)系及其與非小細胞肺癌鉑類化療后的預后指標的相關性成為鉑類化療方案在非小細胞肺癌中應用的關鍵問題。為了明確ERCC1和RRM1基因在非小細胞肺癌對鉑類化療藥物敏感性的作用，在本課題中我們通過前瞻性臨床研究，分析ERCC1及RRM1基因在297例中／晚期，接受鉑類化療方案NSCLC患者中的表達水平，與患者的臨床指標進行臨床相關性分析，探討這兩個基因在非小細胞肺癌在鉑類化療藥物敏感性的相關性，系統(tǒng)評估ERCC1及RRM1基因作為預測鉑類化療藥物對非小細胞肺癌患者應用后的療效是否具有臨床指導意義。 本研究中，我們收集了2007年9月和2009年9月之間，323例就診于吉林大學第二醫(yī)院胸外科，局部晚期或出現(xiàn)轉移無法接受手術切除的非小細胞肺癌（TNM分期：IIIB期和IV期NSCLC）患者血液組織標本。將入組條件設為：首次接受鉑類化療至少兩個療程的患者，纖維支氣管鏡或經皮穿刺取病理組織，經病理診斷后明確無法進行手術治療的IIIB或IV期非小細胞肺癌，WHO體力狀態(tài)（WHOperformance status）為0-2，并可直接檢測腫瘤對鉑類化療藥物反應的患者。臨床輔助檢查數(shù)據(jù)和影像學圖片均來源于吉林大學第二醫(yī)院胸外科病歷紀錄。非小細胞肺癌的病理學分類依據(jù)世界衛(wèi)生組織標準（WHO，1981）進行分類。以下情況中出現(xiàn)任何一項的患者均排除在入組條件之外：繼發(fā)性肺部腫瘤，出現(xiàn)妊娠，伴有嚴重心肺功能不全和嚴重營養(yǎng)不良等并發(fā)癥的病人。所有患者（包括入組及未入組的患者）均簽署了書面知情同意書。我們的研究方案經吉林大學第二醫(yī)院的倫理委員會審核后獲批準。入組的所有患者就診后均接受了標準的鉑類聯(lián)合化療方案。該方案包括：第1天接受75mg/m2的順鉑或卡鉑，并在第1天和第8天接受1000mg/m2的吉西他濱；或者在第1天和第8天應用25mg/m2的長春瑞濱，或第1天給予175mg/m2紫杉醇。當接受鉑類化療的患者出現(xiàn)疾病突然惡化或患者無法承受化療藥物毒性時，鉑類化療即時終止。根據(jù)腫瘤對鉑類聯(lián)合化療的反應，將患者分組為化療藥物高反應組及化療藥物低反應組�；颊弑憩F(xiàn)為經鉑類化療后呈完全緩解或出現(xiàn)部分緩解被定義為高反應，而患者經鉑類化療后腫瘤并無變化或反而惡性進展則被定義為低反應。我們主要借助在入組患者接受鉑類化療前后接受的胸部X線及胸部CT等影像學檢查以明確腫瘤對鉑類化療藥物的反應性�？傮w生存期為（OS）指從直至患者死亡或隨訪結束日期。本研究入組所有患者均需要提供5ml全血樣本，血樣采集完畢后標上患者信息與采血時間，并立即保存于－70o C超低溫冰箱，直到試驗開始�；颊哐獦又锌俁NA的提取采用EZNA血液RNA小提試劑盒EZNA Blood RNA Mini Kit(Omega, Berkeley, CA, USA)，具體方法請見實驗方法及實驗記錄本。將RNA通過反轉錄PCR逆轉錄為cDNA后，通過實時定量PCR（qRT－PCR）方法檢測ERCC1和RRM1的mRNA表達水平。將actin蛋白設為內參，選取相對定量法進行計算。qRT－PCR反應體系為20μL:模板DNA含量為50ng，加入200μM的dNTP，2.5units Taq DNA聚合酶（Promega Corporation, Madison, WI, USA）以及200μM的引物。PCR程序設為：94℃預熱2分鐘，解鏈94C30秒，退火64C30秒，延伸72℃1分鐘，終止反應4℃，反應循環(huán)數(shù)為35。為了增強實驗組與對照組試驗數(shù)據(jù)可靠性，避免人為的實驗操作誤差，我們抽取所有的病例和對照組病例中10％作為隨機樣本進行基因測試，結果表明我們的試驗結果前后一致，可重復率為100％。數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包處理，應用Excel作圖，用F檢驗首先進行方差分析，以t檢驗判斷差異顯著性。連續(xù)變量以均數(shù)±標準差，分類變量則表示為頻率和百分比。ERCC1和RRM1表達與化療反應之間的相關性主要通過OR值（odd ratio）及95％可信區(qū)間（CI）來進行評估。ERCC1和RRM1表達與非小細胞肺癌的操作系統(tǒng)之間的關系由Cox回歸模型的危險比（hazard ratio, HR）及其95％可信區(qū)間（CI）的評估。所有患者的OS時間繪制采用Kaplan-Meier生存曲線法。P 0.05視為具有統(tǒng)計學顯著差異，所有的監(jiān)測都是雙向測試。 所有的323例非小細胞肺癌病例中，297位患者同意參加本試驗，參與率高達91.95％�？傮w患者的年齡中位數(shù)為61.5歲（34.6-74.1歲之間）。全體非小細胞肺癌患者中69.1％為男性，57.5％的患者處于TNM分期IV。病理學分型：非小細胞肺癌中的腺癌和鱗狀細胞癌的分別占到56.7％和37.4％。54.5％的非小細胞肺癌患者經ECOG體能測試后，處于第1-2階段。在隨訪期間，由于聯(lián)系方式更迭，我們失去了5例患者的隨訪信息。所有患者均隨訪至2012年9月。在隨訪結束時，132人出現(xiàn)死亡，165例病情呈惡性進展。研究結束時，中位OS分別為18.7個月（1－60個月）。我們通過qRT－PCR方法檢測ERCC1和RRM1mRNA的表達水平，β-actin蛋白設為內參，進行相對定量分析。ERCC1和RRM1的平均表達水平分別為2.46×10-2和0.97×10-2。我們通過與ERCC1和RRM1mRNA表達水平中位數(shù)比較，將患者群體分為高表達或低表達組。在所有297例病人中，146例患者表現(xiàn)出完全化療后緩解，151例經過化療后部分得到緩解�；颊咧蠩RCC1低表達的患者相對于高表達患者，對化療呈高反應性，出現(xiàn)完全緩解的病例較多，在95％可信區(qū)間內OR值為1.56（1.03-2.47）。為了探討ERCC1和RRM1的表達水平與患者生存期之間的相關性，我們通過Cox回歸模型，分析患者ERCC1和RRM1的mRNA表達量與總體生存期OS之間的相關性。我們發(fā)現(xiàn)，ERCC1水平低的患者群體與其高表達患者群體相比，擁有更長的生存期：95％可信區(qū)間內標準化危險系數(shù)HR為0.57（0.35-0.93）。 近年來，分子靶向藥物的研發(fā)、靶向藥物與化療藥物的聯(lián)合使用、個體化治療的發(fā)展，使某些腫瘤的治療效果顯著提高，腫瘤藥物治療取得階段性的進展。盡管如此，分子靶向抗腫瘤藥物也面臨諸多的問題與挑戰(zhàn)：療效不確定、易產生耐藥、毒副作用大、聯(lián)合用藥盲目等問題一直沒有得到很好的解決�？拱﹤�體化治療指根據(jù)癌癥患者的特異性基因型，采用針對患者特異性遺傳信息如預后分子標記物，制定最佳的治療方案，對患者病程進行有效干預的治療方法。我們的研究表明，ERCC1基因的表達水平可以提示非小細胞肺癌腫瘤細胞對鉑類化療的敏感性，其表達水平在預示患者接受鉑類化療的預后過程中呈獨立因素。攜帶ERCC1低表達的患者群體與ERCC1高表達患者群體相比，其生存期顯著延長。在小樣本研究中已有人發(fā)現(xiàn)ERCC1低表達的患者群體與ERCC1高表達患者群體相比，對鉑類化療藥物具有更高的敏感性。我們的研究結果與先前的研究結果一致。然而，亦有研究發(fā)現(xiàn)ERCC1的表達水平與患者的生存或治療預后無明顯相關性。我們分析：ERCC1的表達可能僅在晚期非小細胞肺癌預后具有臨床指導意義。 鑒于ERCC1在細胞NER途徑中扮演者重要的角色，是NER途徑的關鍵限速酶，而NER途徑在惡性腫瘤對鉑類化療藥物敏感性中起著重要作用，由此不難推測ERCC1基因的表達在不同人類惡性腫瘤對鉑類化療的反應過程中起到一定的調控作用。已有大量研究報道，在人類不同的惡性腫瘤中ERCC1參與腫瘤的鉑類耐藥機制中，這些惡性腫瘤包括胃癌，結直腸癌，膀胱癌以及非小細胞肺癌。Huang等人的研究報道稱，ERCC1的表達是III期結直腸癌患者接受FOLFOX方案輔助化療出現(xiàn)早期耐藥現(xiàn)象的一個重要預測因子，而檢測患者體內ERCC1的表達水平有助于醫(yī)生根據(jù)其表達結果對病人采取不同的治療方案，并從而提高結腸癌患者對化療藥物的反應，增強鉑類化療藥物的殺傷性。Li等人曾就美國胃癌患者進行臨床相關性研究，提出ERCC1和ERCC2功能性SNP位點可能影響胃癌患者的生存期。而在非小細胞肺癌中ERCC1的表達與非小細胞肺癌患者預后之間的相關性則尚有一定爭議，在不同的研究中得出不一致的結論。Tantraworasin課題組在247例接受肺癌根治術的晚期非小細胞肺癌病人中進行了一項回顧性臨床研究，發(fā)現(xiàn)ERCC1和RRM1的表達并不影響腫瘤復發(fā)和患者的總生存期。Ozdemir的等人的研究結果也提示，ERCC1的表達水平與患者的生存期或患者對治療的反應并無顯著的相關性。而在Vassalou等人在希臘的非小細胞肺癌患者中進行的一項研究表明，ERCC1可以很好的提示患者接受化學治療后的預后，因而對個體化化療治療晚期非小細胞肺癌具有重要的臨床指導意義。此外，最近的一項循證醫(yī)學meta分析研究表明ERCC1基因低表達或不表達的患者與ERCC1高表達患者相比，其對治療有更好的反應，生存期顯著延長。由于缺乏單一變量，即研究對象存在種族，對照受試者的來源，樣本大小以及偶發(fā)事件對臨床相關性研究均起著一定的干擾作用，因此ERCC1在非小細胞肺癌患者的臨床研究呈不同的結果。因此，如何克服干擾因素，全面系統(tǒng)深入研究ERCC1基因多態(tài)性與非小細胞肺癌患者預后之間的相關性，并在大臨床樣本中不斷驗證，成為目前肺癌領域函待解決的重要問題。與此同時，越來越多的研究通過免疫組化方法證實RRM1蛋白的表達水平可以在不同的人類惡性腫瘤中預示患者的預后，這些腫瘤包括乳腺癌，胰腺癌和胃癌等。已有研究表明RRM1基因在非小細胞肺癌患者的表達水平與患者的預后無明確的相關性。與早前的研究結果一致，在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)RRM1表達水平在接受輔助化療或未接受輔助化療的晚期NSCLC患者中無顯著的臨床相關性。 綜上所述，我們的結果表明，ERCC1的mRNA低表達預示晚期非小細胞肺癌患者對鉑類化療方案具有更好的敏感性，提示患者接受鉑類化療后生存期延長。因此，我們提出ERCC1在mRNA水平的表達水平可作為制定非小細胞肺癌個體化治療的重要參考指標。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【共引文獻】

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本文編號：1797831