本文選題：ERCC1 + mRNA　； 參考：《吉林大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：肺癌在全球范圍內(nèi)是致死率最高的惡性腫瘤（InternationalAgency for Research on Cancer, IARC， http://www.iarc.fr）。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌病理類型中最常見(jiàn)的肺癌，占所有肺癌病例70%以上（IARC，2008）。據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO最新調(diào)查，肺癌的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為33.5例／100，000人，在男性中為45.9例／100，000人，明顯高于女性21.3例／100，000人。雖然傳統(tǒng)外科等治療手段的日益進(jìn)步已經(jīng)極大地改善了肺癌患者的預(yù)后及生存質(zhì)量，但由于目前對(duì)肺癌發(fā)病的分子機(jī)制缺乏深入的認(rèn)識(shí)，因此現(xiàn)有的早期診斷靶標(biāo)及抗癌治療對(duì)肺癌患者的作用也顯得非常有限。據(jù)報(bào)道，在首次就診的非小細(xì)胞肺癌患者中，超過(guò)50％的病例已進(jìn)展為III期或已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。而最近，鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案被認(rèn)為是治療晚期非小細(xì)胞肺癌最有效的方法之一。然而，腫瘤是高度異質(zhì)性疾病，即便處于同樣臨床分期或病理類型相同的肺癌患者，對(duì)鉑類化療藥物的敏感性往往呈顯著差異。 目前學(xué)界普遍認(rèn)為非小細(xì)胞肺癌的基因型差異與機(jī)體對(duì)鉑類為基礎(chǔ)的化療藥物的敏感性具有一定的相關(guān)性。鉑類化療藥物，如順鉑及卡鉑是目前抗癌化療藥物中應(yīng)用最為普及，療效最為明確的抗癌藥物之一，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。鉑類藥物進(jìn)入細(xì)胞核后與核內(nèi)DNA結(jié)合，通過(guò)形成鉑-DNA絡(luò)合物，導(dǎo)致DNA不可逆性損傷，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡(apoptosis)，從而發(fā)揮其抗癌作用。由于細(xì)胞內(nèi)存在DNA損傷修復(fù)機(jī)制，鉑類化療藥物造成的DNA損傷部分可由細(xì)胞通過(guò)募集DNA損傷修復(fù)相關(guān)因子進(jìn)行修復(fù)，因此DNA修復(fù)過(guò)程中調(diào)控因子的表達(dá)及其功能被認(rèn)為在腫瘤對(duì)鉑類化療藥物的敏感性起著重要的決定作用。這些分子的表達(dá)及其功能的異常激活，可以通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類化療藥物的耐受性，影響鉑類化療藥物在非小細(xì)胞肺癌患者中應(yīng)用療效。核苷酸切除修復(fù)機(jī)制（NER）是DNA修復(fù)途徑中最為主要的途徑之一，可以切除修復(fù)順鉑誘導(dǎo)及UV輻照產(chǎn)生的DNA損傷。目前人們已發(fā)現(xiàn)20余種參與NER修復(fù)途徑的酶蛋白，可以特異性識(shí)別DNA損傷片段，通過(guò)協(xié)同作用共同完成DNA損傷修復(fù)過(guò)程。切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1-ERCC1便是其中最為關(guān)鍵的限速酶，，與XPF共同負(fù)責(zé)催化基因5’端切口，NER途徑中起著重要的作用。核糖核苷酸還原酶M1亞基基因（RRM1）在人類基因組中位于染色體11p15.5位點(diǎn)，其編碼蛋白負(fù)責(zé)催化脫氧核糖核苷酸的生物合成，在DNA合成中起著重要的調(diào)控作用。 以往的研究表明，ERCC1和RRM1在非小細(xì)胞肺癌患者中與鉑類抗癌化療藥物的敏感性密切相關(guān)，并有可能影響非小細(xì)胞肺癌化療后預(yù)后。Kotoula等人，2012; Leng等人，2012。但迄今為止，ERCC1與RRM1分別在非小細(xì)胞肺癌鉑類抗癌治療敏感性及其他臨床相關(guān)指標(biāo)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。尤其是ERCC1和RRM1兩個(gè)基因之間的聯(lián)系及其與非小細(xì)胞肺癌鉑類化療后的預(yù)后指標(biāo)的相關(guān)性成為鉑類化療方案在非小細(xì)胞肺癌中應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題。為了明確ERCC1和RRM1基因在非小細(xì)胞肺癌對(duì)鉑類化療藥物敏感性的作用，在本課題中我們通過(guò)前瞻性臨床研究，分析ERCC1及RRM1基因在297例中／晚期，接受鉑類化療方案NSCLC患者中的表達(dá)水平，與患者的臨床指標(biāo)進(jìn)行臨床相關(guān)性分析，探討這兩個(gè)基因在非小細(xì)胞肺癌在鉑類化療藥物敏感性的相關(guān)性，系統(tǒng)評(píng)估ERCC1及RRM1基因作為預(yù)測(cè)鉑類化療藥物對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者應(yīng)用后的療效是否具有臨床指導(dǎo)意義。 本研究中，我們收集了2007年9月和2009年9月之間，323例就診于吉林大學(xué)第二醫(yī)院胸外科，局部晚期或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移無(wú)法接受手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌（TNM分期：IIIB期和IV期NSCLC）患者血液組織標(biāo)本。將入組條件設(shè)為：首次接受鉑類化療至少兩個(gè)療程的患者，纖維支氣管鏡或經(jīng)皮穿刺取病理組織，經(jīng)病理診斷后明確無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療的IIIB或IV期非小細(xì)胞肺癌，WHO體力狀態(tài)（WHOperformance status）為0-2，并可直接檢測(cè)腫瘤對(duì)鉑類化療藥物反應(yīng)的患者。臨床輔助檢查數(shù)據(jù)和影像學(xué)圖片均來(lái)源于吉林大學(xué)第二醫(yī)院胸外科病歷紀(jì)錄。非小細(xì)胞肺癌的病理學(xué)分類依據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)（WHO，1981）進(jìn)行分類。以下情況中出現(xiàn)任何一項(xiàng)的患者均排除在入組條件之外：繼發(fā)性肺部腫瘤，出現(xiàn)妊娠，伴有嚴(yán)重心肺功能不全和嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良等并發(fā)癥的病人。所有患者（包括入組及未入組的患者）均簽署了書(shū)面知情同意書(shū)。我們的研究方案經(jīng)吉林大學(xué)第二醫(yī)院的倫理委員會(huì)審核后獲批準(zhǔn)。入組的所有患者就診后均接受了標(biāo)準(zhǔn)的鉑類聯(lián)合化療方案。該方案包括：第1天接受75mg/m2的順鉑或卡鉑，并在第1天和第8天接受1000mg/m2的吉西他濱；或者在第1天和第8天應(yīng)用25mg/m2的長(zhǎng)春瑞濱，或第1天給予175mg/m2紫杉醇。當(dāng)接受鉑類化療的患者出現(xiàn)疾病突然惡化或患者無(wú)法承受化療藥物毒性時(shí)，鉑類化療即時(shí)終止。根據(jù)腫瘤對(duì)鉑類聯(lián)合化療的反應(yīng)，將患者分組為化療藥物高反應(yīng)組及化療藥物低反應(yīng)組�；颊弑憩F(xiàn)為經(jīng)鉑類化療后呈完全緩解或出現(xiàn)部分緩解被定義為高反應(yīng)，而患者經(jīng)鉑類化療后腫瘤并無(wú)變化或反而惡性進(jìn)展則被定義為低反應(yīng)。我們主要借助在入組患者接受鉑類化療前后接受的胸部X線及胸部CT等影像學(xué)檢查以明確腫瘤對(duì)鉑類化療藥物的反應(yīng)性�？傮w生存期為（OS）指從直至患者死亡或隨訪結(jié)束日期。本研究入組所有患者均需要提供5ml全血樣本，血樣采集完畢后標(biāo)上患者信息與采血時(shí)間，并立即保存于－70o C超低溫冰箱，直到試驗(yàn)開(kāi)始。患者血樣中總RNA的提取采用EZNA血液RNA小提試劑盒EZNA Blood RNA Mini Kit(Omega, Berkeley, CA, USA)，具體方法請(qǐng)見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)記錄本。將RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（qRT－PCR）方法檢測(cè)ERCC1和RRM1的mRNA表達(dá)水平。將actin蛋白設(shè)為內(nèi)參，選取相對(duì)定量法進(jìn)行計(jì)算。qRT－PCR反應(yīng)體系為20μL:模板DNA含量為50ng，加入200μM的dNTP，2.5units Taq DNA聚合酶（Promega Corporation, Madison, WI, USA）以及200μM的引物。PCR程序設(shè)為：94℃預(yù)熱2分鐘，解鏈94C30秒，退火64C30秒，延伸72℃1分鐘，終止反應(yīng)4℃，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35。為了增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性，避免人為的實(shí)驗(yàn)操作誤差，我們抽取所有的病例和對(duì)照組病例中10％作為隨機(jī)樣本進(jìn)行基因測(cè)試，結(jié)果表明我們的試驗(yàn)結(jié)果前后一致，可重復(fù)率為100％。數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，應(yīng)用Excel作圖，用F檢驗(yàn)首先進(jìn)行方差分析，以t檢驗(yàn)判斷差異顯著性。連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，分類變量則表示為頻率和百分比。ERCC1和RRM1表達(dá)與化療反應(yīng)之間的相關(guān)性主要通過(guò)OR值（odd ratio）及95％可信區(qū)間（CI）來(lái)進(jìn)行評(píng)估。ERCC1和RRM1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的操作系統(tǒng)之間的關(guān)系由Cox回歸模型的危險(xiǎn)比（hazard ratio, HR）及其95％可信區(qū)間（CI）的評(píng)估。所有患者的OS時(shí)間繪制采用Kaplan-Meier生存曲線法。P 0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，所有的監(jiān)測(cè)都是雙向測(cè)試。 所有的323例非小細(xì)胞肺癌病例中，297位患者同意參加本試驗(yàn)，參與率高達(dá)91.95％�？傮w患者的年齡中位數(shù)為61.5歲（34.6-74.1歲之間）。全體非小細(xì)胞肺癌患者中69.1％為男性，57.5％的患者處于TNM分期IV。病理學(xué)分型：非小細(xì)胞肺癌中的腺癌和鱗狀細(xì)胞癌的分別占到56.7％和37.4％。54.5％的非小細(xì)胞肺癌患者經(jīng)ECOG體能測(cè)試后，處于第1-2階段。在隨訪期間，由于聯(lián)系方式更迭，我們失去了5例患者的隨訪信息。所有患者均隨訪至2012年9月。在隨訪結(jié)束時(shí)，132人出現(xiàn)死亡，165例病情呈惡性進(jìn)展。研究結(jié)束時(shí)，中位OS分別為18.7個(gè)月（1－60個(gè)月）。我們通過(guò)qRT－PCR方法檢測(cè)ERCC1和RRM1mRNA的表達(dá)水平，β-actin蛋白設(shè)為內(nèi)參，進(jìn)行相對(duì)定量分析。ERCC1和RRM1的平均表達(dá)水平分別為2.46×10-2和0.97×10-2。我們通過(guò)與ERCC1和RRM1mRNA表達(dá)水平中位數(shù)比較，將患者群體分為高表達(dá)或低表達(dá)組。在所有297例病人中，146例患者表現(xiàn)出完全化療后緩解，151例經(jīng)過(guò)化療后部分得到緩解�；颊咧蠩RCC1低表達(dá)的患者相對(duì)于高表達(dá)患者，對(duì)化療呈高反應(yīng)性，出現(xiàn)完全緩解的病例較多，在95％可信區(qū)間內(nèi)OR值為1.56（1.03-2.47）。為了探討ERCC1和RRM1的表達(dá)水平與患者生存期之間的相關(guān)性，我們通過(guò)Cox回歸模型，分析患者ERCC1和RRM1的mRNA表達(dá)量與總體生存期OS之間的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，ERCC1水平低的患者群體與其高表達(dá)患者群體相比，擁有更長(zhǎng)的生存期：95％可信區(qū)間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化危險(xiǎn)系數(shù)HR為0.57（0.35-0.93）。 近年來(lái)，分子靶向藥物的研發(fā)、靶向藥物與化療藥物的聯(lián)合使用、個(gè)體化治療的發(fā)展，使某些腫瘤的治療效果顯著提高，腫瘤藥物治療取得階段性的進(jìn)展。盡管如此，分子靶向抗腫瘤藥物也面臨諸多的問(wèn)題與挑戰(zhàn)：療效不確定、易產(chǎn)生耐藥、毒副作用大、聯(lián)合用藥盲目等問(wèn)題一直沒(méi)有得到很好的解決�？拱﹤�(gè)體化治療指根據(jù)癌癥患者的特異性基因型，采用針對(duì)患者特異性遺傳信息如預(yù)后分子標(biāo)記物，制定最佳的治療方案，對(duì)患者病程進(jìn)行有效干預(yù)的治療方法。我們的研究表明，ERCC1基因的表達(dá)水平可以提示非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類化療的敏感性，其表達(dá)水平在預(yù)示患者接受鉑類化療的預(yù)后過(guò)程中呈獨(dú)立因素。攜帶ERCC1低表達(dá)的患者群體與ERCC1高表達(dá)患者群體相比，其生存期顯著延長(zhǎng)。在小樣本研究中已有人發(fā)現(xiàn)ERCC1低表達(dá)的患者群體與ERCC1高表達(dá)患者群體相比，對(duì)鉑類化療藥物具有更高的敏感性。我們的研究結(jié)果與先前的研究結(jié)果一致。然而，亦有研究發(fā)現(xiàn)ERCC1的表達(dá)水平與患者的生存或治療預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性。我們分析：ERCC1的表達(dá)可能僅在晚期非小細(xì)胞肺癌預(yù)后具有臨床指導(dǎo)意義。 鑒于ERCC1在細(xì)胞NER途徑中扮演者重要的角色，是NER途徑的關(guān)鍵限速酶，而NER途徑在惡性腫瘤對(duì)鉑類化療藥物敏感性中起著重要作用，由此不難推測(cè)ERCC1基因的表達(dá)在不同人類惡性腫瘤對(duì)鉑類化療的反應(yīng)過(guò)程中起到一定的調(diào)控作用。已有大量研究報(bào)道，在人類不同的惡性腫瘤中ERCC1參與腫瘤的鉑類耐藥機(jī)制中，這些惡性腫瘤包括胃癌，結(jié)直腸癌，膀胱癌以及非小細(xì)胞肺癌。Huang等人的研究報(bào)道稱，ERCC1的表達(dá)是III期結(jié)直腸癌患者接受FOLFOX方案輔助化療出現(xiàn)早期耐藥現(xiàn)象的一個(gè)重要預(yù)測(cè)因子，而檢測(cè)患者體內(nèi)ERCC1的表達(dá)水平有助于醫(yī)生根據(jù)其表達(dá)結(jié)果對(duì)病人采取不同的治療方案，并從而提高結(jié)腸癌患者對(duì)化療藥物的反應(yīng)，增強(qiáng)鉑類化療藥物的殺傷性。Li等人曾就美國(guó)胃癌患者進(jìn)行臨床相關(guān)性研究，提出ERCC1和ERCC2功能性SNP位點(diǎn)可能影響胃癌患者的生存期。而在非小細(xì)胞肺癌中ERCC1的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性則尚有一定爭(zhēng)議，在不同的研究中得出不一致的結(jié)論。Tantraworasin課題組在247例接受肺癌根治術(shù)的晚期非小細(xì)胞肺癌病人中進(jìn)行了一項(xiàng)回顧性臨床研究，發(fā)現(xiàn)ERCC1和RRM1的表達(dá)并不影響腫瘤復(fù)發(fā)和患者的總生存期。Ozdemir的等人的研究結(jié)果也提示，ERCC1的表達(dá)水平與患者的生存期或患者對(duì)治療的反應(yīng)并無(wú)顯著的相關(guān)性。而在Vassalou等人在希臘的非小細(xì)胞肺癌患者中進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明，ERCC1可以很好的提示患者接受化學(xué)治療后的預(yù)后，因而對(duì)個(gè)體化化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌具有重要的臨床指導(dǎo)意義。此外，最近的一項(xiàng)循證醫(yī)學(xué)meta分析研究表明ERCC1基因低表達(dá)或不表達(dá)的患者與ERCC1高表達(dá)患者相比，其對(duì)治療有更好的反應(yīng)，生存期顯著延長(zhǎng)。由于缺乏單一變量，即研究對(duì)象存在種族，對(duì)照受試者的來(lái)源，樣本大小以及偶發(fā)事件對(duì)臨床相關(guān)性研究均起著一定的干擾作用，因此ERCC1在非小細(xì)胞肺癌患者的臨床研究呈不同的結(jié)果。因此，如何克服干擾因素，全面系統(tǒng)深入研究ERCC1基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性，并在大臨床樣本中不斷驗(yàn)證，成為目前肺癌領(lǐng)域函待解決的重要問(wèn)題。與此同時(shí)，越來(lái)越多的研究通過(guò)免疫組化方法證實(shí)RRM1蛋白的表達(dá)水平可以在不同的人類惡性腫瘤中預(yù)示患者的預(yù)后，這些腫瘤包括乳腺癌，胰腺癌和胃癌等。已有研究表明RRM1基因在非小細(xì)胞肺癌患者的表達(dá)水平與患者的預(yù)后無(wú)明確的相關(guān)性。與早前的研究結(jié)果一致，在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)RRM1表達(dá)水平在接受輔助化療或未接受輔助化療的晚期NSCLC患者中無(wú)顯著的臨床相關(guān)性。 綜上所述，我們的結(jié)果表明，ERCC1的mRNA低表達(dá)預(yù)示晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)鉑類化療方案具有更好的敏感性，提示患者接受鉑類化療后生存期延長(zhǎng)。因此，我們提出ERCC1在mRNA水平的表達(dá)水平可作為制定非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化治療的重要參考指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1797831