本文選題：肌細胞增強因子2D + 惡性膠質(zhì)瘤　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景和目的惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腦腫瘤,約占所有腦腫瘤的50%以上,星形細胞瘤是最常見的腦膠質(zhì)瘤。根據(jù)他們的侵襲性,世界衛(wèi)生組織(WHO)將它們劃分為(1)I級:毛細胞型星形細胞瘤(PA),好發(fā)于兒童;(2)II級:低度惡性星形細胞瘤(LGA),占所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤的25%,好發(fā)年齡為30-40歲;(3)III級:間變型星形細胞瘤(AA),易轉(zhuǎn)化為Ⅳ級;(4)IV級:多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM),好發(fā)年齡為45~60歲。惡性星形細胞瘤(MA)主要包括AA及GBM,其中GBM占50%~80%。其中I級和II級的低度惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(LGG)和III級和IV級或高度惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(HGG)。在過去的十年中,盡管在腦膠質(zhì)瘤治療方面,包括手術(shù)切除、放化療及腫瘤免疫治療等綜合治療取得了巨大的進展,但高度惡性膠質(zhì)瘤患者中位生存期僅12-15個月,主要是由于對惡性膠質(zhì)瘤形成的潛在分子機制缺乏了解。腦惡性膠質(zhì)瘤具有侵襲性極高、預(yù)后極差的生物學(xué)特點,從而導(dǎo)致其易復(fù)發(fā),死亡率高,為了有效解決這一臨床難題,非常有必要深入研究惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生及侵襲的分子機制,識別參與膠質(zhì)瘤形成與發(fā)展的新基因,從而有針對性的研究預(yù)防和治療惡性膠質(zhì)瘤,才能有效的尋找新的治療策略,改善患者的預(yù)后。肌細胞增強因子2家族(myocyte enhancer factor 2,MEF2)是一類發(fā)揮多種生理功能的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,該家族包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D四個成員。它們在骨骼肌、心肌、神經(jīng)組織和免疫系統(tǒng)的發(fā)育過程和正常生理功能的維持中發(fā)揮重要功能。如同其他重要的發(fā)育相關(guān)因子一樣,MEF2D也參與了癌癥的發(fā)生過程。MEF2D促使正常細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象在白血病中被首先報道。部分急性淋巴細胞白血病的患者的1號染色體與19號染色體發(fā)生易位,造成了MEF2D部分編碼區(qū)與DAZAP1發(fā)生融合,產(chǎn)生了MEF2D/DAZAP1與DAZAP1/MEF2D兩種融合蛋白。通過體外細胞實驗,研究者發(fā)現(xiàn)過表達MEF2D不僅賦予正常細胞在低血清條件下的增殖能力,加快其分裂速度,而且對細胞凋亡的產(chǎn)生也有抑制作用,能夠增強轉(zhuǎn)化細胞的存活。后來有研究發(fā)現(xiàn),MEF2D參與了肝癌的發(fā)生。研究證實,MEF2D在肝癌中異常高表達,這種高表達與肝癌的預(yù)后不良相關(guān)。而且MEF2D通過調(diào)控細胞周期g2/m,在肝癌的致瘤性方面扮演著重要角色。在肝癌細胞中下調(diào)mef2d表達,將導(dǎo)致細胞生長抑制。有研究證實mef2d的替代多聚腺苷酸化亞型在正常和gbm腦組織差異表達。而且,mef2家族蛋白還參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)因子2的調(diào)控。此外,mef2d能夠激活bcl-w的轉(zhuǎn)錄表達,這使得mef2d可以在腫瘤細胞的抗凋亡中發(fā)揮作用。然而,對于mef2d在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的表達譜和功能知之甚少。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)mef2d在惡性膠質(zhì)瘤組織及惡性膠質(zhì)瘤細胞系(u87mg、u251mg)中異常高表達,不斷有證據(jù)表明mef2d表達可能是惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生和進展中的關(guān)鍵因子。在這項研究中,我們試圖研究惡性膠質(zhì)瘤中mef2d的功能和表達,通過研究mef2d表達水平與惡性膠質(zhì)瘤細胞致瘤性的相關(guān)性,進一步闡明mef2d在惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生中的生物學(xué)功能,提供新的用于惡性膠質(zhì)瘤臨床預(yù)后參考的蛋白分子,為今后針對惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展制定新的治療策略提供新靶點。方法:1.細胞系和細胞培養(yǎng)人惡性膠質(zhì)瘤細胞系,u87mg(從含有g(shù)fap陽性細胞惡性腦瘤衍生)和u251mg(從一個惡性膠質(zhì)瘤患者分類為iv級來源的),hela細胞(hela細胞用作mef2d陽性對照)均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。初級星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物根據(jù)前人方法所述取得。生長環(huán)境:細胞培養(yǎng)液dmem,10%胎牛血清,置于含有5%二氧化碳、37攝氏度的培養(yǎng)箱中,根據(jù)細胞在鏡下觀察的生長情況,判定細胞傳代時間,通常每1-2天將生長旺盛的u87mg、u251mg、hela、星形膠質(zhì)細胞傳代。2.原代培養(yǎng)/倫理聲明本研究所采用的人腦惡性膠質(zhì)瘤標本(腫瘤組織及癌旁正常組織)從成都軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除獲得,由成都軍區(qū)總醫(yī)院的倫理審查委員會審查批準,并取得病人或親屬的書面知情同意。惡性膠質(zhì)瘤組織切成小塊。機械操縱后獲得單細胞懸浮液。對于原發(fā)性星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng),樣品按照前人方法(具體見實驗部分)的程序,由成都軍區(qū)總醫(yī)院的倫理審查委員會批準,取得孕婦的書面知情同意,從流產(chǎn)胎兒獲得。方法簡要地說,在除去腦膜后,從前囟腦組織切成片,用胰蛋白酶消化。將消化的細胞通過一個鋼網(wǎng)過濾并在補充有15%fbs中dmem中培養(yǎng),免疫熒光法檢測gfap的表達。3.免疫組化免疫組織染色是關(guān)于使用鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶連接法,對手術(shù)獲取的惡性膠質(zhì)瘤標本,進行福爾馬林固定、石蠟包埋和組織切片。用mef2d和ki67抗體分別檢測mef2d和ki67的表達。蘇木素用于對細胞核染色。根據(jù)tunel細胞凋亡檢測試劑盒的實驗方法進行凋亡實驗。4.實時熒光定量pcr(qrt-pcr)根據(jù)rna提取試劑盒的操作指南對惡性膠質(zhì)瘤細胞系(u87mg、u251mg)提取總rna。實時熒光定量pcr按照前人實驗描述的方法進行。簡要地說,第一鏈cdna合成和擴增根據(jù)primescripttmrt試劑盒的操作進行;實時熒光定量pcr根據(jù)sybr預(yù)混料前的taq與rotor-gene的6000qrt-pcr系統(tǒng)的操作說明進行。以下為引物序列:mef2d(正向)5'-agggaaataaccaaaaaactaccaaa-3';mef2d(反向)5'-gctacatgaacacaaaaacagagacc-3';gapdh(正向)5'-gcgagatcgcactcatcatct-3';gapdh(反向)5'-tcagtggtggacctgacc-3'。gapdh的mrna水平被用于歸一化。在基因表達水平上的變化倍數(shù)使用2△△ct法計算。5.病毒載體慢病毒載體由王博士(病理科,哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院)提供,其中包括lv-gfp(過表達綠色熒光蛋白對照組),lv-mef2d(過表達mef2d),lv-shmef2d-1、lv-shmef2d-2(不同程度下調(diào)mef2d表達)和lv-ctrl(陰性對照組)。6.westernblot分析根據(jù)標準實驗方法進行蛋白質(zhì)樣品和免疫印記。簡言之,將細胞用裂解緩沖液在12,000rpm離心15min后,用bca蛋白測定試劑盒對組織或細胞蛋白質(zhì)的濃度進行測定。然后通過sds-page在凝膠上分離總蛋白。7.增殖試驗被不同慢病毒感染后的細胞以1000個每孔的濃度種植于96孔板中。mts溶液(3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2h-etrazolium,innersalt,四氮唑藍鹽化合物)根據(jù)promega推薦的方法來檢測細胞增殖率。8.克隆形成實驗u87mg細胞用文中所示的慢病毒載體感染后,按照每個培養(yǎng)皿2000個細胞濃度接種在3.5cm的培養(yǎng)皿中。u251mg細胞和星形膠質(zhì)細胞用文中所示的慢病毒載體感染后,每孔100個細胞的濃度接種于24孔板中。將細胞放置在37℃,在5%co2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天。隨后將細胞用福爾馬林固定,用結(jié)晶紫染色。我們定義50個細胞作為一個克隆。9.細胞周期檢測通過流式細胞儀pi染色后如前人中描述的細胞周期流程操作。簡而言之,將細胞鋪于6孔板中,每孔2×105個細胞的濃度并用慢病毒處理。處理后48小時,收集細胞于240μlpbs和560μl的100%乙醇中,并在-20℃下固定過夜。細胞沉淀通過離心收集,并再懸浮于含有20mmedta和1mg/mlrna酶的500μlpbs中,然后在37℃下孵育1小時。pi溶液(50微克/毫升)的混合物用于樣品染色。然后將樣品進行流式細胞儀分析,并在536nm的激發(fā)波長和617nm的發(fā)射波長進行檢測。10.流式細胞儀檢測細胞凋亡將需檢測的細胞鋪于6孔板中,每孔2×105個細胞的濃度,并用慢病毒處理。慢病毒處理后48小時,收集細胞,胰蛋白酶處理,并用完全培養(yǎng)基洗滌一次。細胞(5×105)重新懸浮500μl1×bindingbuffer緩沖液中,并用異硫氰酸熒光素(fitc)標記的膜聯(lián)蛋白v染色。染色后立即進行流式細胞儀檢測分析。11.動物實驗研究六周齡的雄性balb/c裸小鼠用于本研究,購自成都達碩實驗動物有限公司。在小鼠(n=12)顱內(nèi)注射感染了10moi的lv-shmef2d-1或lv-ctrl5×106u87mg細胞。40天內(nèi)每天記錄他們的死亡情況。所有動物實驗均經(jīng)成都軍區(qū)總醫(yī)院動物研究倫理審查委員會審查通過。腫瘤的體積通過公式計算“v=(長度×寬度2)/2”。12.統(tǒng)計分析每組實驗至少重復(fù)三次,實驗所得數(shù)據(jù),采用spss20.0軟件進行統(tǒng)計分析。mef2d表達和存活之間的相關(guān)性由秩數(shù)檢驗評估。mef2d表達與其他變量之間的關(guān)系,我們使用了兩種獨立樣本t檢驗。實時熒光定量pcr、細胞的生長速度和克隆形成的結(jié)果均通過雙側(cè)獨立樣本t檢驗。比較多樣本量差異的顯著性使用單向評估anova或雙向anova方差分析,所有數(shù)值以平均值±標準差表示。p0.05(*)和p0.01(**)分別表示“差異顯著”和“差異非常顯著”。結(jié)果:1.mef2d表達水平升高預(yù)示惡性膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良。為了研究mef2d的在患有惡性膠質(zhì)瘤患者預(yù)后中的作用,我們使用qrt-pcr法進行檢測惡性膠質(zhì)瘤患者中mef2d的mrna水平。在iii級和iv級組織學(xué)分類的惡性膠質(zhì)瘤標本中,分為一個mef2d高組和mef2d低組(我們通過相對定量rq平均值定義mef2d高/低)。與mef2d低組中相比,在mef2d高組中的患者預(yù)后較差(p=0.031)。此外,這些患者的樣本mef2dmrna水平與世界衛(wèi)生組織分級(2007年)正相關(guān)(p=0.048)。idh1/2突變也與mef2dmrna水平正相關(guān)(p=0.029)。但是,mef2dmrna水平和組織學(xué)分類之間沒有顯著的關(guān)聯(lián)(p=0.064)。為了確認mef2d在腫瘤細胞中的定位,我們對惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本進行免疫組織化學(xué)檢測。免疫組織化學(xué)染色表明,mef2d蛋白主要定位于癌細胞的細胞核中。因此,通過westernblot和免疫組化評估,mef2d蛋白的表達水平在惡性膠質(zhì)瘤腫瘤組織與鄰近正常組織相比表達更高。mef2dmrna表達水平在這些樣品中也通過qrt-pcr進行測定,mef2d在腫瘤組織中mrna的表達水平比相鄰的正常組織表達顯著更高(p=0.03,0.02和0.02)。此外,與mef2d的蛋白水平低的星形膠質(zhì)細胞相比,u87mg,u251mg和hela癌細胞(hela細胞用作mef2d陽性細胞系),mef2d在癌細胞系中的表達水平比星形膠質(zhì)細胞更高(p0.04)。這些結(jié)果表明,惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系具有異常高表達的mef2d。2.mef2d下調(diào)抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系的增殖。因為惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系的mef2d表達水平高,我們用攜帶特異性靶向的mef2dmrna的短發(fā)夾rna的慢病毒載體(lv-shmef2d-1,lv-shmef2d-2)或?qū)φ战M(lv-ctrl)感染的u87mg和u251mg細胞。感染后72小時,我們通過免疫印跡和qrt-pcr檢測,研究u87mg和u251mg細胞的mef2d蛋白和mrna的水平。在u87mg和u251mg惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中,lv-shmef2d-1和lv-shmef2d-2導(dǎo)致了大約65-95%mef2d蛋白表達下降。qrt-pcr數(shù)據(jù)還顯示,在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中,shrna也下調(diào)了mef2d的mrna水平。mef2d下調(diào)被認為減少了u87mg細胞的增殖。在感染lv-shmef2d-1或lv-shmef2d-2的u251mg細胞中也有同樣的情況,但對照組lv-ctrl細胞沒有這種效果(p=0.02和0.01)。此外,u87mg細胞感染lv-shmef2d-1或lv-shmef2d-2后的細胞克隆數(shù)受此影響,隨mef2d的水平下降而減少(p=0.01和0.01)。在u251mg細胞中也得到了類似的結(jié)果(p=0.01和0.02)。因此,mef2d的下調(diào)可以減少u87mg和u251mg細胞中的克隆數(shù),這表明mef2d在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系的增殖中至關(guān)重要。3.mef2d影響惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系的細胞周期和凋亡。為了研究mef2d促進惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系的增殖機制,使用流式細胞術(shù)分析細胞周期進程。u87mg和u251mg惡性膠質(zhì)瘤細胞感染了lv-shmef2d-1,lv-shmef2d-2,或是lv-ctrl。這與此前肝癌中的報道結(jié)果相一致,在u87mg和u251mg細胞沉默mef2d表達導(dǎo)致細胞周期的s期和g2/m期的阻滯。mef2d可以調(diào)節(jié)在肝癌中靶基因如cdkn1a,gadd45a,和gadd45b的轉(zhuǎn)錄。為了證實在惡性膠質(zhì)瘤中,mef2d是否調(diào)節(jié)這些基因,我們研究了mef2d的靶基因mrna水平。我們的數(shù)據(jù)證實,在u87mg細胞中沉默mef2d表達導(dǎo)致cdkn1a,gadd45a和gadd45b的表達增加。我們還研究mfe2d的下調(diào)是否導(dǎo)致惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。使用流式細胞術(shù)分析檢測lv-shmef2d-1或lv-shmef2d-2處理后的腫瘤細胞凋亡水平。凋亡細胞的百分比通過fitc-膜聯(lián)蛋白v/pi染色來確定。我們的數(shù)據(jù)表明,不同mef2d水平細胞凋亡率顯著不同。在lv-shmef2d-1和lv-shmef2d-2感染組凋亡率分別為39.4%和38.2%。與此相反,lv-ctrl感染組有較低的凋亡率(6.1%)。這些結(jié)果表明,mef2d通過誘導(dǎo)細胞周期s期和g2/m期的延遲,影響腫瘤細胞凋亡、抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖。另外,剪切的parp水平表明,細胞凋亡途徑被誘導(dǎo)。因此,在mef2d沉默的細胞系中,剪切的parp蛋白的水平升高。綜上所述,我們的結(jié)果強化了先前的發(fā)現(xiàn),即mef2d促進癌細胞的增殖,參與細胞周期進展,并且在抑制細胞凋亡中起重要作用。4.mef2d的過表達促進星形膠質(zhì)細胞的增殖和細胞周期進程。我們接下來研究mef2d過表達是否促進了正常腦的星形膠質(zhì)細胞的增殖和細胞周期進程。感染過表達lv-mef2d的星形膠質(zhì)細胞的mef2d水平升高,western印跡分析證實感染lv-mef2d之后的mef2d蛋白水平顯著增加。qrt-pcr數(shù)據(jù)表明,lv-mef2d感染的星形膠質(zhì)細胞的mfe2d的mrna水平高于對照細胞(p=0.01)。通過mts測定感染lv-mef2d或lv-gfp的星形膠質(zhì)細胞的增殖率。我們發(fā)現(xiàn),mef2d過表達增加星形膠質(zhì)細胞的增殖(p=0.03)。此外,與對照病毒相比(lv-gfp),過表達mef2d升高星形膠質(zhì)細胞的菌落數(shù)(p=0.04)。此外,我們對慢病毒過表達mef2d的星形膠質(zhì)細胞的細胞周期進程進行了評估的。在星形膠質(zhì)細胞的過度表達mef2d增加g0/g1期的細胞的百分比,同時降低細胞百分比中的g2/m和s期�？偟膩碚f,mef2d促進星形膠質(zhì)細胞的增殖,并加速在星形膠質(zhì)細胞g2/m期的過渡。5.mef2d的下調(diào)削弱了惡性膠質(zhì)瘤細胞的致瘤性。為了研究mef2d是否促進惡性膠質(zhì)瘤的致瘤性,在已建立的小鼠惡性膠質(zhì)瘤模型基礎(chǔ)上進行mef2d下調(diào)影響的檢測。與對照組相比,mef2d低表達的惡性膠質(zhì)瘤異種移植組具有更高的存活率。值得注意的是,顱內(nèi)注射的u87mg細胞40天后,mef2d缺陷組有50%的存活率,而對照組均沒有存活。lv-shmef2d-1感染組(5.6±5.3立方毫米)比Lv-CTRL感染組中腫瘤的平均大小顯著較小(15.2±8.7立方毫米)(P=0.04)。Western免疫印跡、q RT-PCR和免疫組化染色檢測均顯示MEF2D在LV-CTRL感染組腫瘤中存在廣泛表達,而在LV-sh MEF2D-1感染組的腫瘤中,MEF2D的表達明顯降低。為了確認移植了shMEF2D的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的小鼠的存活率增加是否是由于細胞增殖抑制或細胞毒作用影響,我們通過Ki67染色和TUNEL測定法,分別分析移植瘤腫瘤細胞的增殖和凋亡。結(jié)果表明,相比于Lv-CTRL感染組,Lv-shMEF2D-1感染組具有更弱的Ki67染色和更強的TUNEL染色。對MEF2D表達情況、Ki67和TUNEL陽性細胞進行計數(shù)。結(jié)果表明在Lv-CTRL-和Lv-shMEF2D-1治療組,MEF2D陽性率分別為82.5%,3.9%。Lv-CTRL-和Lv--shMEF2D-1治療組的Ki67在細胞中表達百分比分別為64.2%和28.6%。TUNEL染色表明他們的凋亡率分別為8.6%和57.8%。這些結(jié)果表明體內(nèi)的MEF2D缺陷降低了惡性膠質(zhì)瘤的致瘤性。結(jié)論:1.在惡性膠質(zhì)瘤患者標本中,異常高表達MEF2D,從而導(dǎo)致惡性膠質(zhì)瘤的預(yù)后較差。2.通過下調(diào)MEF2D介導(dǎo)了細胞周期S期和G2/M期的阻滯并促進細胞凋亡,進而抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系的增殖。3.MEF2D在星形膠質(zhì)細胞的過度表達通過調(diào)節(jié)細胞周期進程加速細胞增殖。4.裸鼠惡性膠質(zhì)瘤模型顯示,MEF2D缺乏可以阻止惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤在體內(nèi)形成。5.最后我們的結(jié)論是MEF2D可以充當惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在致癌基因,因此可作為一個惡性膠質(zhì)瘤治療的候選目標。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1797580