本文選題：視網膜母細胞瘤 + miR-125a-5p�。� 參考：《南京大學》2017年博士論文

【摘要】：視網膜母細胞瘤(Retinoblastoma,RB)是在嬰幼兒中發(fā)生的最常見的眼內惡性腫瘤,其侵襲轉移能力強,嚴重危害著患者的生命以及視力。雖然目前的臨床治療水平逐漸提高,治療目標也從拯救患兒生命到保存視力提高患兒生活質量,但部分患者就診時已處于晚期,腫瘤已經向其他部位侵襲,治療效果差。所以,實現(xiàn)挽救患者視力這樣的治療目標關鍵在于早期診斷。miRNA是一類短小序列的內源性非編碼RNA,長度約為21-25個核苷酸,其通過影響互補mRNA的翻譯和穩(wěn)定性來調節(jié)轉錄后水平的基因表達發(fā)揮作用。在這一領域,越來越多的證據表明,miRNA可以通過下調致癌靶標或通過負調節(jié)抑癌基因蛋白的腫瘤啟動子起到腫瘤抑制劑類似的作用。研究表明miR-125a-5p在多種人類腫瘤中表達異常,并發(fā)揮著抑制癌癥的作用,抑制多種人類癌癥的生長和轉移,包括卵巢癌,肝細胞癌和乳腺癌。但miR-125a-5p在視網膜母細胞瘤中發(fā)揮的作用尚不清楚。1.研究材料和方法1.1臨床樣本的收集和細胞培養(yǎng)在視網膜母細胞瘤患兒進行眼球摘除手術過程中收集視網膜母細胞瘤組織及其配對的非腫瘤視網膜組織。標本收集后一部分迅速保存于液氮中,另一部份標本進行病理檢查。購買視網膜母細胞瘤細胞株Y79細胞和WERI-Rb-1細胞。1.2視網膜母細胞瘤中異常表達miRNAs篩選及目標miRNA的選擇與驗證采用生物芯片初步篩選在視網膜母細胞瘤組織中表達水平顯著改變的miRNAs,再使用實時定量PCR技術在臨床視網膜母細胞瘤組織和視網膜母細胞瘤細胞株中對其中改變最為明顯的miR-125a-5p進行表達驗證。利用miR-125a-5p表達水平來區(qū)分視網膜母細胞瘤組織和正常視網膜組織。探索miR-125a-5p的表達水平與視網膜母細胞瘤病理特征的相關性。1.3 miR-125a-5p對視網膜母細胞瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響通過轉染使miR-125a-5p在視網膜母細胞瘤表達水平增加,利用各種分子細胞生物學和顯微成像技術,觀察視網膜母細胞瘤細胞的增殖(細胞計數(shù)法、MTT法)、遷移(Transwell法)和侵襲(Matrigel侵襲實驗)等細胞行為學的變化。1.4建立軟瓊脂克隆形成實驗和裸鼠視網膜母細胞瘤模型,研究miR-125a-5p對視網膜母細胞瘤生長情況的影響軟瓊脂克隆形成實驗檢測miR-125a-5p的表達水平對視網膜母細胞瘤生長發(fā)展情況的影響。建立裸鼠皮下成瘤模型,裸鼠皮下注射視網膜母細胞瘤細胞,監(jiān)測瘤體及小鼠生長情況。皮下注射1-2周后肉眼可見瘤體時,頸椎脫臼處死裸鼠,測量瘤體大小,使用公式V=LW2/2計算出腫瘤體積,繪制生長曲線。1.5 miR-125a-5p下游靶點TAZ的驗證應用TargetScan、MiRanda和PicTar預測軟件,分析相關因素,采用miRWalk數(shù)據庫篩選出TAZ具有作為miR-125a-5p下游靶點的可能性。隨后利用雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-125a-5p對靶TAZ的負調控作用,在視網膜母細胞瘤細胞中過表達miR-125a-5p后使用蛋白印跡實驗檢測下游標靶TAZ的蛋白水平。分析視網膜母細胞瘤手術取得組織中TAZ的蛋白水平,并對其和miR-125a-5p的表達水平作相關性分析。1.6 miR-125a-5p下游直接靶點TAZ對視網膜母細胞瘤的生物學功能的研究利用RNAi技術敲低視網膜母細胞瘤細胞中TAZ的表達水平,利用各種分子細胞生物學和顯微成像技術,觀察視網膜母細胞瘤細胞的增殖(細胞計數(shù)法、MTT法)、遷移(Transwell法)和侵襲(Matrigel侵襲實驗)等生物學行為的變化,再通過在已經過表達miR-125a-5p的視網膜母細胞瘤細胞中過表達TAZ探究逆轉miR-125a-5p的抑制作用能夠被逆轉。2.主要研究結果2.1 miR-125a-5p在視網膜母細胞瘤組織和視網膜母細胞瘤細胞株Y79細胞和WERI-Rb-1細胞中的表達水平明顯下調,miR-125a-5p的表達水平對于區(qū)分視網膜母細胞瘤組織和視網膜非腫瘤組織具有顯著差異。統(tǒng)計學結果顯示miR-125a-5p的表達水平與視網膜母細胞瘤的TNM分期存在顯著相關性。2.2外源性過表達miR-125a-5p能顯著抑制視網膜母細胞瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及瘤體的生長。2.3 TAZ是miR-125a-5p的直接下游靶點。TAZ在視網膜母細胞瘤組織和細胞株中表達較配對的非腫瘤視網膜組織增高。過表達miR-125a-5p能明顯降低TAZ的表達水平。MiR-125a-5p和TAZ在視網膜母細胞瘤中的表達水平呈負相關性。2.4敲低TAZ的表達水平能夠抑制視網膜母細胞瘤細胞的增殖、遷移和侵襲的能力,與過表達miR-125a-5p作用相似。并且,在過表達miR-125a-5p的基礎上再過表達TAZ能部分或完全逆轉miR-125a-5p對視網膜母細胞瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和瘤體生長的抑制作用。3.結論3.1 miR-125a-5p在視網膜母細胞瘤組織中的表達水平明顯下調,并與視網膜母細胞瘤TNM分期呈負相關,提示miR-125a-5p可能在視網膜母細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮類似抑癌基因的作用。3.2過表達miR-125a-5p或敲低TAZ的表達水平均能明顯抑制視網膜母細胞瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,miR-125a-5p過表達對視網膜母細胞瘤產生的抑制作用能被其下游直接靶點TAZ逆轉,提示miR-125a-5p可能通過調控TAZ的表達來參與視網膜母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程。3.3用miR-125a-5p的表達水平能顯著區(qū)分視網膜母細胞瘤組織和非視網膜母細胞瘤組織。同時,miR-125a-5p及其下游直接靶點TAZ在視網膜母細胞瘤中的表達水平呈現(xiàn)負相關性,提示miR-125a-5p和TAZ均有可能成為視網膜母細胞瘤診斷或治療的新靶點。
[Abstract]:In this field , the expression of miR - 125a - 5p can be regulated by down - regulation of the expression level of miR - 125a - 5p and the expression level of miR - 125a - 5p . Conclusion : The expression level of miR - 125a - 5p and miR - 125a - 5p can significantly decrease the proliferation , migration , invasion and tumor growth .

【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.7

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