本文選題：人膀胱間充質(zhì)干細胞 + 膀胱尿路上皮癌　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：一、研究背景膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。膀胱癌占中國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的首位。膀胱尿路上皮癌既往被稱為膀胱移行細胞癌,它是最常見的膀胱惡性腫瘤類型,占膀胱癌患者總數(shù)的80%以上。目前膀胱尿路上皮癌總體呈現(xiàn)出發(fā)病率升高與年輕化的特點,早期非浸潤型膀胱癌外科手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率高,行膀胱根治性切除術(shù)后患者生活質(zhì)量顯著下降。膀胱尿路上皮癌對放化療的敏感性較低,一旦腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后較差。針對膀胱尿路上皮癌的治療急需一種新的治療靶點以提高治療效果。腫瘤是由許多類型的細胞組成的一種器官樣結(jié)構(gòu)。這些細胞通過相互作用,推動和促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。致癌細胞從本地和鄰近組織中招募非致瘤性細胞,同時通過循環(huán)系統(tǒng)構(gòu)建腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境可以交互消息,刺激腫瘤的生長。它包含癌相關(guān)成纖維細胞,內(nèi)皮細胞,免疫細胞,脂肪細胞,分化成轉(zhuǎn)移性上皮細胞的癌癥干細胞,具有分化成為成纖維細胞和間充質(zhì)細胞譜系中的代表性細胞能力的間充質(zhì)干細胞/基質(zhì)細胞,以及不同類型的細胞外基質(zhì)蛋白。他們通過旁分泌信號及物理性作用相互影響,促進癌癥的進展。這些不同的癌癥間質(zhì),特別是間充質(zhì)干細胞和從干細胞中提取的基質(zhì)細胞,最近已被確認從腫瘤發(fā)生的早期開始影響腫瘤的生長、發(fā)展、進展,在癌癥患病過程中扮演重要的角色。它通過上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)變和轉(zhuǎn)移,影響微環(huán)境的構(gòu)造,使得腫瘤得以維護并轉(zhuǎn)移到其他組織。膀胱粘膜下層和基質(zhì)層中存在間質(zhì)細胞。我們推測膀胱組織中存在間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC),因為MSC廣泛分部于人體組織中,目前可以從骨髓、肌肉、脂肪、臍帶等多種具有間質(zhì)的組織中分離得到。MSC具有向多組織細胞分化的潛能,能產(chǎn)生和分泌多種細胞因子和生長因子,參與炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等。因此,深入研究膀胱間充質(zhì)干細胞與膀胱尿路上皮癌之間的關(guān)系,可能為治療癌癥、預(yù)防復(fù)發(fā)提供新策略。二、研究目的本論文探索從人膀胱組織中分離培養(yǎng)得到膀胱間充質(zhì)干細胞(human bladder derived Mesenchymal stem cells,h BSC)的實驗方法,進而分析h BSC與脂肪、骨髓等其他組織來源間充質(zhì)干細胞的差別,然后通過誘導(dǎo)h BSC三系分化及向其它類型膀胱組織細胞的分化實驗以進一步驗證其干細胞潛能。然后通過與癌細胞系的共培養(yǎng)測量細胞的生長與遷移并研究其可能的機制。最后在營養(yǎng)缺乏環(huán)境下檢測實驗細胞凋亡率,評估h BSC對膀胱癌細胞系細胞自噬作用的影響其作用機制。據(jù)此探索膀胱間充質(zhì)干細胞在膀胱尿路上皮癌疾病發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用機制。三、主要研究內(nèi)容1.從全膀胱癌切除的正常組織中分離培養(yǎng)人膀胱間充質(zhì)干細胞(h BSC),流式細胞儀鑒定細胞表面抗原分子,誘導(dǎo)h BSC向成脂、成骨和成軟骨三系分化,誘導(dǎo)h BSC向其他類型膀胱組織細胞分化;2.從細胞增殖、端粒酶活性以及細胞因子分泌幾個方面比較h BSC與骨髓和臍帶來源的人間充質(zhì)干細胞的差別;3.將h BSC與膀胱癌細胞系5637和J82通過transwell小室共培養(yǎng),或收集h BSC條件性培養(yǎng)基用于5637和J82培養(yǎng),測定細胞增殖和細胞遷移,Western blot檢測p70、AKT和STAT3蛋白質(zhì)的磷酸化水平,熒光定量PCR檢測EMT相關(guān)基因表達。4.收集h BSC條件性培養(yǎng)基用于5637和J82培養(yǎng),細胞免疫熒光檢測LAMP2,Western blot檢測細胞自噬基因LC3B,轉(zhuǎn)染EGFP-LC3B質(zhì)粒觀察處理后的熒光蛋白分布,Annexin V-FITC標記后采用流式細胞儀檢測營養(yǎng)缺乏時的細胞凋亡率,評估h BSC對膀胱癌細胞系細胞自噬作用的影響。四、結(jié)果1.分離得到的人膀胱間充質(zhì)干細胞(h BSC),建立合適的培養(yǎng)體系,流式細胞儀鑒定h BSC表達CD13、CD29、CD73、CD90和CD105分子,不表達CD14、CD19、CD31、CD34、CD45和HLA-DR,低表達HLA-ABC。h BSC經(jīng)過誘導(dǎo)可分化成為脂肪、骨和軟骨細胞,經(jīng)特殊培養(yǎng)基誘導(dǎo)能夠分化成尿路上皮樣、內(nèi)皮樣及平滑肌樣細胞。2.h BSC與人骨髓來源間充質(zhì)干細胞(h BM-MSC)和人臍帶來源間充質(zhì)干細胞(h UC-MSC)比較,h BSC和h UC-MSC的細胞生長速度相同,但h BSC的端粒酶活性卻與h BM-MSC相似,細胞因子分泌方面h BSC中EGF、IGF1、IL-1β和IL-6的分泌量略高于h BM-MSC和h UC-MSC。3.h BSC與膀胱癌細胞系5637和J82共培養(yǎng),采用transwell共培養(yǎng)或條件培養(yǎng)基培養(yǎng)都能夠促進5637生長及遷移,而對J82的作用不明顯,機制分析認為胞內(nèi)p70和STAT3蛋白質(zhì)被誘導(dǎo)磷酸化是5637細胞生長速度增加的重要原因,而h BSC促進5637細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化,從而促進5637遷移。4.低血清或無血清饑餓時,h BSC的條件培養(yǎng)基能夠促進5637細胞自噬,誘導(dǎo)胞內(nèi)LC3BⅡ增加,LC3B和LAMP2在5637細胞中出現(xiàn)點狀聚集。五、結(jié)論通過本課題建立的方法,可以從人膀胱粘膜下層和肌層組織中分離得到膀胱間充質(zhì)干細胞。人膀胱間充質(zhì)干細胞(h BSC)具有與其他組織來源間充質(zhì)干細胞相同的細胞表面抗原分子和三系分化能力。h BSC細胞增殖、端粒酶活性和細胞因子分泌與其他組織來源MSC相比較有其特點。h BSC能夠促進體外共培養(yǎng)的膀胱癌細胞系5637生長,在此過程中,m TOR和STAT3途徑可能起到重要作用;h BSC能夠誘導(dǎo)5627細胞EMT轉(zhuǎn)變,從而促進細胞遷移。在血清饑餓時h BSC促進5637細胞自噬和存活。本課題研究提高了人們對膀胱組織細胞構(gòu)成的認知,認識到人膀胱間充質(zhì)干細胞在膀胱尿路上皮癌細胞生長及遷移等生理過程中發(fā)揮重要作用,提出人膀胱間充質(zhì)干細胞可能是膀胱尿路上皮癌治療的新靶點。
[Abstract]:Bladder cancer is one of the most common malignant tumors in the genitourinary system. Bladder cancer accounts for the highest incidence of urogenital cancer in China. Bladder urothelial carcinoma is formerly known as bladder transitional cell carcinoma. It is the most common type of bladder cancer, accounting for more than 80% of the total number of bladder cancer. The overall incidence of cancer was higher and younger. The recurrence rate of early non invasive bladder cancer was higher after surgical treatment. The quality of life decreased significantly after radical cystectomy. The sensitivity of bladder urothelial carcinoma to radiotherapy and chemotherapy was low, and the prognosis of the patients was poor. Cancer therapy is in urgent need of a new therapeutic target to improve the therapeutic effect. A tumor is an organ like structure composed of many types of cells. These cells promote and promote tumor growth and metastasis through interaction. Carcinogenic cells recruit non tumorigenic cells from local and adjacent tissues and construct tumors through a circulatory system. Microenvironment. A tumor microenvironment can interact messages to stimulate the growth of a tumor. It contains cancer related fibroblasts, endothelial cells, immune cells, adipocytes, cancer stem cells differentiated into metastatic epithelial cells, and a mesenchymal stem cell / base that differentiates into the representative cell capacity of fibroblasts and mesenchymal cells. Stromal cells and different types of extracellular matrix proteins. They interact with each other through paracrine signals and physical effects to promote cancer progress. These different cancers, especially mesenchymal stem cells and stromal cells extracted from stem cells, have recently been confirmed to affect the growth of the tumor from the early stage of the tumorigenesis. Development, progress, plays an important role in the process of cancer disease. It affects the microstructure of the microenvironment through the transformation and transfer of epithelial stroma, which enables the tumor to be maintained and transferred to other tissues. Interstitial cells exist in the submucosa of the bladder and the matrix layer. We speculate that the mesenchymal stem cell exists in the bladder fabric. MSC), because MSC is widely used in human tissue, it is possible to separate the potential of.MSC from bone marrow, muscle, fat, umbilical cord and many other interstitial tissues, which can produce and secrete a variety of cytokines and growth factors, participate in inflammatory reactions and tumorigenesis. The relationship between stromal cells and bladder urothelial carcinoma may provide a new strategy for the treatment of cancer and prevention of recurrence. Two. The purpose of this paper is to explore the experimental methods of separating and cultivating human bladder derived Mesenchymal stem cells, H BSC from human bladder tissue, and then analyzing h BSC and fat, bone marrow The differentiation of mesenchymal stem cells from other tissue sources, and then the differentiation of H BSC three lines and differentiation to other types of bladder tissue cells to further verify their stem cell potential. Then the possible mechanism of cell growth and migration was measured by co culture with the cancer cell lines and the possible mechanisms were studied. Finally, in the nutritional deficiency environment. To detect the apoptosis rate of experimental cells and evaluate the effect of H BSC on the autophagy of bladder cancer cell line, and to explore the mechanism of action of bladder mesenchymal stem cells in the development of bladder urothelial carcinoma. Three, main content 1. isolated and cultured human bladder mesenchyme from normal tissues removed from bladder cancer. H BSC, flow cytometer identified cell surface antigen molecules, induced H BSC to differentiate into fat, osteogenic and chondrogenic three lines, induced H BSC to differentiate into other types of bladder tissue cells, and 2. compared h BSC with human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and umbilical cord from several aspects of cell proliferation, telomerase activity and cytokine secretion. 3. h BSC and bladder cancer cell lines 5637 and J82 were co cultured in Transwell compartment, or H BSC conditioned medium was collected for 5637 and J82 culture, cell proliferation and cell migration, Western blot detection p70, AKT and STAT3 protein phosphorylation level. The culture medium was used in 5637 and J82 culture. Cell immunofluorescence was detected by LAMP2, Western blot was used to detect the autophagy gene LC3B. The distribution of fluorescent protein after transfection of EGFP-LC3B plasmid was observed. The apoptotic rate was detected by flow cytometry after Annexin V-FITC, and the autophagy of the bladder cancer cell line was evaluated by the flow cytometry. Four, four, result 1. isolated human bladder mesenchymal stem cells (H BSC), establish a suitable culture system. Flow cytometer identified h BSC expression CD13, CD29, CD73, CD90 and CD105 molecules, and did not express CD14, CD19, CD31, and differentiated into fat, bone and cartilage cells, through special medium. Induction can differentiate into urinary tract epithelioid, endothelioid and smooth muscle like cells.2.h BSC compared with human mesenchymal stem cells (H BM-MSC) and human umbilical cord derived mesenchymal stem cells (H UC-MSC). The growth rate of H BSC and H UC-MSC is the same, but the telomerase activity of H BSC is similar to that of the human mesenchymal stem cells. The secretion of F, IGF1, IL-1 beta and IL-6 is slightly higher than that of H BM-MSC and H UC-MSC.3.h BSC and bladder cancer cell line 5637 and J82 co culture. The use of Transwell co culture or conditioned medium can promote the growth and migration of 5637, but the effect on J82 is not obvious. Mechanism analysis suggests that intracellular and protein are induced to be phosphorylated in 5637 cells. The important reason for the increase of long speed, while h BSC promotes EMT transformation in 5637 cells, thus promoting the 5637 migration of.4. low serum or serum free starvation, the conditioned medium of H BSC can promote autophagy of 5637 cells, induce intracellular LC3B II increase, LC3B and LAMP2 appear in the 5637 cells. Five. Conclusion the method established through this subject can be established. Human bladder mesenchymal stem cells are isolated from the submucosa and myometrium of human bladder. Human bladder mesenchymal stem cells (H BSC) have the same cell surface antigen molecules as other tissue derived mesenchymal stem cells and the proliferation of three lineage differentiation ability.H BSC cells. Telomerase activity and cytokine secretion are compared with other tissue sources MSC .h BSC can promote the growth of bladder cancer cell line 5637 co cultured in vitro. In this process, m TOR and STAT3 pathway may play an important role. H BSC can induce EMT transformation of 5627 cells and promote cell migration. H BSC promotes autophagy and survival of 5637 cells in serum starvation. The cognition of the composition of the cell is important for the human bladder mesenchymal stem cells to play an important role in the growth and migration of bladder urothelial carcinoma cells. The proposed human bladder mesenchymal stem cells may be a new target for the treatment of bladder urothelial carcinoma.

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.14

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本文編號：1773914