本文選題：iTRAQ + 宮頸癌��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：子宮頸癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一。宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程復雜,雖然HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病主要原因,但是并非所有的HPV感染患者一定會發(fā)展成為宮頸癌,提示HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要非充分條件。在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中有很多基因和蛋白參與其中,并且其具體機制尚未完全闡明,所以尋找宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中特異性的蛋白質,可以為宮頸癌的診治探尋新的靶點,提供新的診治思路。iTRAQ是一種體外同種同位素標記的相對與絕對定量技術,目前已廣泛應用于多種腫瘤標記物的研究。本研究擬使用iTRAQ技術分析宮頸癌與正常宮頸組織進行差異蛋白表達差異的鑒定和定量分析,從差異蛋白質中搜尋與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展密切相關的特異性蛋白質分子。對挑選出的蛋白質分子進行深入分析,明確其在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程中的機制。因此,本課題從分以下三個部分進行研究。第一部分宮頸癌與正常宮頸組織的差異蛋白質組學研究目的:使用蛋白質組學方法篩選出宮頸癌與正常宮頸的差異蛋白,探尋有意義的潛在靶點。方法:(1)使用iTRAQ串聯(lián)質譜技術,對宮頸癌和正常宮頸組織標本中的差異蛋白質進行鑒定和定量分析。(2)使用Westernblot對iTRAQ的結果進行驗證。(3)使用GO-Analysis和Pathway-Analysis對iTRAQ篩選出的差異蛋白進行功能和涉及的信號通路分析。結果:(1)iTRAQ共搜索出3300個具有95%可信區(qū)間的非拓余蛋白。進一步,為減少假陽性的發(fā)生,我們使用宮頸癌和正常宮頸組織表達差異大于1.3倍作為選擇差異蛋白的標準,最終在宮頸癌和正常宮頸組織中篩選出了330個差異蛋白,其中包括137個上調蛋白和193個下調蛋白;(2)Westernblot結果顯示:與正常宮頸組織相比,宮頸癌中LYZ,ORM1,LYN和STMN1的表達明顯上調;與正常宮頸組織相比,宮頸癌中LUM,BGN和KRT4的表達明顯下調。表明Westernblot結果與iTRAQ聯(lián)合質譜方法得到的差異蛋白表達趨勢一致。(3)GO-Analysis結果顯示:上調差異基因的顯著性功能結果包括基因表達、有絲分裂細胞周期和凋亡過程等;下調差異基因的顯著性功能結果包括細胞外基質構建、內肽酶活性負性調節(jié)和肌肉收縮等。Pathway-Analysis結果顯示:上調基因參與的顯著性信號轉導通路包括RNA運輸、剪接、DNA復制、NF-kappaB等;下調基因參與的顯著性信號轉導通路包括粘附、補體系統(tǒng)、血管平滑肌收縮等。結論:(1)iTRAQ技術作為目前蛋白質組學研究的重要工具,也是研究宮頸癌特異性生物標記物性能可靠的工具和平臺;(2)參與宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程的蛋白質及其復雜。第二部分LYN在宮頸癌中組織中的表達情況及與臨床病理參數(shù)的相關性目的:檢測宮頸癌,癌旁組織和正常宮頸組織中LYN的表達情況,探討LYN的表達與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的相關性。方法:(1)使用免疫組織化學檢測宮頸癌組織芯片中LYN的表達情況;(2)統(tǒng)計學分析LYN的表達情況與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的相關性。結果:(1)與癌旁組織和正常宮頸組織相比,宮頸癌組織中LYN的表達明顯上調,并且隨著腫瘤期別的進展,LYN的表達情況逐漸增強。(2)在宮頸癌組織中,LYN的高表達與宮頸癌FIGO分期和腫瘤分級呈正相關,差異有統(tǒng)計學意義。與宮頸癌患者年齡和腫瘤類型(鱗癌與腺鱗癌和腺癌之和相比,因只有一例腺癌標本,故沒有單獨比較)無明顯相關性。結論:(1)LYN在宮頸癌中表達上調,起促癌基因作用;(2)LYN的表達與宮頸癌FIGO分期和腫瘤分級呈正相關,表明LYN在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。第三部分LYN參與調節(jié)宮頸癌生物學行為及其相關機制的研究目的:探討LYN在宮頸癌增殖、侵襲、遷移等生物學行為中的作用及其相關機制。方法:(1)Westernblot和RT-PCR檢測不同宮頸癌細胞株中LYN的表達情況;(2)慢病毒沉默和過表達LYN的表達情況;(3)平板克隆形成實驗和CCK-8實驗檢測沉默和過表達LYN后,宮頸癌細胞增殖能力變化情況;(4)Transwell遷移實驗和劃痕實驗檢測沉默和過表達LYN后,宮頸癌細胞遷移能力變化情況;(5)Transwell侵襲實驗檢測沉默和過表達LYN后,宮頸癌細胞侵襲能力變化情況;(6)鬼筆環(huán)肽標記細胞骨架檢測沉默和過表達LYN后,宮頸癌細胞細胞骨架的變化情況;(7)CoIP檢測LYN和p-STAT3的相互作用;(8)Westernblot檢測沉默和過表達后IL-6/STAT3信號通路相關基因IL-6R,STAT3和p-STAT3的表達情況;(9)Westernblot檢測IL-6作用于宮頸癌細胞最適濃度的測定;(10)Westernblot檢測IL-6作用于宮頸癌細胞后IL-6R,STAT3和p-STAT3的表達情況;(11)裸鼠皮下成瘤檢測沉默和過表達LYN后,對裸鼠皮下成瘤能力的影響;(12)免疫組化檢測瘤體LYN和p-STAT3的表達情況。結果:(1)RT-PCR和Westernblot檢測結果表明:宮頸癌HeLa、SiHa和C33a細胞株中SiHa細胞中LYN表達水平最高,C33a細胞中LYN表達水平最低,我們挑選SiHa細胞作為沉默實驗的研究對象,C33a細胞作為過表達實驗的研究對象;(2)GFP熒光、RT-PCR和Westernblot檢測結果表明,沉默和過表達慢病毒可以有效的沉默和過表達LYN的表達。(3)平板克隆形成實驗和CCK-8實驗表明:沉默和過表達LYN的表達可以抑制和促進宮頸癌細胞細胞增殖能力。(4)Transwell遷移實驗和劃痕實驗表明:沉默和過表達LYN的表達可以抑制和促進宮頸癌細胞細胞遷移能力。(5)Transwell侵襲實驗表明,沉默和過表達LYN的表達可以抑制和促進宮頸癌細胞細胞侵襲能力。(6)鬼筆環(huán)肽標記宮頸癌細胞骨架實驗表明:LYN可以影響宮頸癌的細胞骨架。(7)CoIP實驗表明:p-STAT3與LYN在體內有相互作用。(8)Westernblot結果表明:沉默和過表達LYN可以通過IL-6/STAT3信號通路調節(jié)宮頸癌細胞生物學行為。(9)裸鼠皮下成瘤實驗表明:沉默和過表達LYN在體內水平可以促進和抑制腫瘤生長。(10)免疫組化結果表明:與LV3-NC組相比,LV3-LYN組LYN和p-STAT3表達明顯減弱;與LV5-NC組相比,LV5-LYN組LYN和p-STAT3表達明顯增強。結論:(1)LYN可以調節(jié)宮頸癌增殖、侵襲和遷移等生物學行為;(2)LYN通過IL-6/STAT3信號通路,影響細胞骨架的方式調節(jié)宮頸癌細胞的侵襲和遷移。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

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本文編號：1772219