本文選題：iTRAQ + 宮頸癌　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：子宮頸癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一。宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程復(fù)雜,雖然HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病主要原因,但是并非所有的HPV感染患者一定會發(fā)展成為宮頸癌,提示HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要非充分條件。在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中有很多基因和蛋白參與其中,并且其具體機(jī)制尚未完全闡明,所以尋找宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中特異性的蛋白質(zhì),可以為宮頸癌的診治探尋新的靶點(diǎn),提供新的診治思路。iTRAQ是一種體外同種同位素標(biāo)記的相對與絕對定量技術(shù),目前已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤標(biāo)記物的研究。本研究擬使用iTRAQ技術(shù)分析宮頸癌與正常宮頸組織進(jìn)行差異蛋白表達(dá)差異的鑒定和定量分析,從差異蛋白質(zhì)中搜尋與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)分子。對挑選出的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行深入分析,明確其在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程中的機(jī)制。因此,本課題從分以下三個(gè)部分進(jìn)行研究。第一部分宮頸癌與正常宮頸組織的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究目的:使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選出宮頸癌與正常宮頸的差異蛋白,探尋有意義的潛在靶點(diǎn)。方法:(1)使用iTRAQ串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),對宮頸癌和正常宮頸組織標(biāo)本中的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量分析。(2)使用Westernblot對iTRAQ的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。(3)使用GO-Analysis和Pathway-Analysis對iTRAQ篩選出的差異蛋白進(jìn)行功能和涉及的信號通路分析。結(jié)果:(1)iTRAQ共搜索出3300個(gè)具有95%可信區(qū)間的非拓余蛋白。進(jìn)一步,為減少假陽性的發(fā)生,我們使用宮頸癌和正常宮頸組織表達(dá)差異大于1.3倍作為選擇差異蛋白的標(biāo)準(zhǔn),最終在宮頸癌和正常宮頸組織中篩選出了330個(gè)差異蛋白,其中包括137個(gè)上調(diào)蛋白和193個(gè)下調(diào)蛋白;(2)Westernblot結(jié)果顯示:與正常宮頸組織相比,宮頸癌中LYZ,ORM1,LYN和STMN1的表達(dá)明顯上調(diào);與正常宮頸組織相比,宮頸癌中LUM,BGN和KRT4的表達(dá)明顯下調(diào)。表明Westernblot結(jié)果與iTRAQ聯(lián)合質(zhì)譜方法得到的差異蛋白表達(dá)趨勢一致。(3)GO-Analysis結(jié)果顯示:上調(diào)差異基因的顯著性功能結(jié)果包括基因表達(dá)、有絲分裂細(xì)胞周期和凋亡過程等;下調(diào)差異基因的顯著性功能結(jié)果包括細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建、內(nèi)肽酶活性負(fù)性調(diào)節(jié)和肌肉收縮等。Pathway-Analysis結(jié)果顯示:上調(diào)基因參與的顯著性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括RNA運(yùn)輸、剪接、DNA復(fù)制、NF-kappaB等;下調(diào)基因參與的顯著性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括粘附、補(bǔ)體系統(tǒng)、血管平滑肌收縮等。結(jié)論:(1)iTRAQ技術(shù)作為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具,也是研究宮頸癌特異性生物標(biāo)記物性能可靠的工具和平臺;(2)參與宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程的蛋白質(zhì)及其復(fù)雜。第二部分LYN在宮頸癌中組織中的表達(dá)情況及與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性目的:檢測宮頸癌,癌旁組織和正常宮頸組織中LYN的表達(dá)情況,探討LYN的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。方法:(1)使用免疫組織化學(xué)檢測宮頸癌組織芯片中LYN的表達(dá)情況;(2)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析LYN的表達(dá)情況與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果:(1)與癌旁組織和正常宮頸組織相比,宮頸癌組織中LYN的表達(dá)明顯上調(diào),并且隨著腫瘤期別的進(jìn)展,LYN的表達(dá)情況逐漸增強(qiáng)。(2)在宮頸癌組織中,LYN的高表達(dá)與宮頸癌FIGO分期和腫瘤分級呈正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與宮頸癌患者年齡和腫瘤類型(鱗癌與腺鱗癌和腺癌之和相比,因只有一例腺癌標(biāo)本,故沒有單獨(dú)比較)無明顯相關(guān)性。結(jié)論:(1)LYN在宮頸癌中表達(dá)上調(diào),起促癌基因作用;(2)LYN的表達(dá)與宮頸癌FIGO分期和腫瘤分級呈正相關(guān),表明LYN在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。第三部分LYN參與調(diào)節(jié)宮頸癌生物學(xué)行為及其相關(guān)機(jī)制的研究目的:探討LYN在宮頸癌增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為中的作用及其相關(guān)機(jī)制。方法:(1)Westernblot和RT-PCR檢測不同宮頸癌細(xì)胞株中LYN的表達(dá)情況;(2)慢病毒沉默和過表達(dá)LYN的表達(dá)情況;(3)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測沉默和過表達(dá)LYN后,宮頸癌細(xì)胞增殖能力變化情況;(4)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測沉默和過表達(dá)LYN后,宮頸癌細(xì)胞遷移能力變化情況;(5)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測沉默和過表達(dá)LYN后,宮頸癌細(xì)胞侵襲能力變化情況;(6)鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架檢測沉默和過表達(dá)LYN后,宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞骨架的變化情況;(7)CoIP檢測LYN和p-STAT3的相互作用;(8)Westernblot檢測沉默和過表達(dá)后IL-6/STAT3信號通路相關(guān)基因IL-6R,STAT3和p-STAT3的表達(dá)情況;(9)Westernblot檢測IL-6作用于宮頸癌細(xì)胞最適濃度的測定;(10)Westernblot檢測IL-6作用于宮頸癌細(xì)胞后IL-6R,STAT3和p-STAT3的表達(dá)情況;(11)裸鼠皮下成瘤檢測沉默和過表達(dá)LYN后,對裸鼠皮下成瘤能力的影響;(12)免疫組化檢測瘤體LYN和p-STAT3的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)RT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果表明:宮頸癌HeLa、SiHa和C33a細(xì)胞株中SiHa細(xì)胞中LYN表達(dá)水平最高,C33a細(xì)胞中LYN表達(dá)水平最低,我們挑選SiHa細(xì)胞作為沉默實(shí)驗(yàn)的研究對象,C33a細(xì)胞作為過表達(dá)實(shí)驗(yàn)的研究對象;(2)GFP熒光、RT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果表明,沉默和過表達(dá)慢病毒可以有效的沉默和過表達(dá)LYN的表達(dá)。(3)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)表明:沉默和過表達(dá)LYN的表達(dá)可以抑制和促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞增殖能力。(4)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)表明:沉默和過表達(dá)LYN的表達(dá)可以抑制和促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞遷移能力。(5)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明,沉默和過表達(dá)LYN的表達(dá)可以抑制和促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞侵襲能力。(6)鬼筆環(huán)肽標(biāo)記宮頸癌細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)表明:LYN可以影響宮頸癌的細(xì)胞骨架。(7)CoIP實(shí)驗(yàn)表明:p-STAT3與LYN在體內(nèi)有相互作用。(8)Westernblot結(jié)果表明:沉默和過表達(dá)LYN可以通過IL-6/STAT3信號通路調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為。(9)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明:沉默和過表達(dá)LYN在體內(nèi)水平可以促進(jìn)和抑制腫瘤生長。(10)免疫組化結(jié)果表明:與LV3-NC組相比,LV3-LYN組LYN和p-STAT3表達(dá)明顯減弱;與LV5-NC組相比,LV5-LYN組LYN和p-STAT3表達(dá)明顯增強(qiáng)。結(jié)論:(1)LYN可以調(diào)節(jié)宮頸癌增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為;(2)LYN通過IL-6/STAT3信號通路,影響細(xì)胞骨架的方式調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

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本文編號：1772219