本文選題：SATB-1 + 前列腺癌　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：全國(guó)腫瘤登記中心的數(shù)據(jù)顯示,前列腺癌是近幾年來(lái),中國(guó)大陸地區(qū)發(fā)病率逐年爬升的惡性腫瘤之一。隨著我國(guó)居民生活水平的提高和生活方式的改變,特別是近年來(lái),人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)的變化,我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率正呈現(xiàn)較快的上升趨勢(shì),已躍居泌尿生殖男性系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位,仍有進(jìn)一步升高的趨勢(shì)。因?yàn)榍傲邢偬禺愋钥乖?Prostate Specific Antigen, PSA)等普查不夠普及,我國(guó)的初發(fā)即表現(xiàn)為晚期的前列腺癌患者比例遠(yuǎn)高于西方國(guó)家,這一現(xiàn)象在農(nóng)村地區(qū)尤為突出。在我國(guó),前列腺癌患者初診時(shí)常常已經(jīng)是腫瘤晚期,其中大約有40%的人已經(jīng)出現(xiàn)有局部或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移,僅僅小于30%的患者有手術(shù)機(jī)會(huì),導(dǎo)致我國(guó)前列腺癌患者的普遍預(yù)后較差。已有的各項(xiàng)研究表明,諸多危險(xiǎn)因素參與了前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展。盡管在前列腺癌基因水平的研究取得眾多新進(jìn)展,但是轉(zhuǎn)移性前列腺癌的有效臨床治療仍然面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。進(jìn)一步的解剖、病理、影像等研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)診斷為前列腺癌時(shí),前列腺腫瘤細(xì)胞已經(jīng)侵犯到前列腺外科包膜,甚至發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。通過(guò)研究前列腺癌的發(fā)生原因、發(fā)展機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上尋找前列腺癌的治療方法,成為泌尿外科領(lǐng)域的重要研究課題。PCa的發(fā)生是一個(gè)異常復(fù)雜的過(guò)程,諸多遺傳、種族、年齡、生活習(xí)慣、環(huán)境等因素與其相關(guān)：腫瘤的產(chǎn)生又經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟和多個(gè)階段。早在1941年,Huggins等首先報(bào)告了前列腺癌的雄激素依賴,并采取外科去勢(shì)的方式治療前列腺癌,取得了明顯的治療療效。臨床通過(guò)手術(shù)或藥物去勢(shì),同時(shí)使用雄激素受體括抗劑來(lái)降低體內(nèi)雄激素水平,完全性雄激素阻斷治療仍然是目前治療前列腺癌的重要方法。由于發(fā)生突變或者翻譯后的修飾,雄激素受體的功能缺失,最終導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)雄激素產(chǎn)生耐受。近期的研究也發(fā)現(xiàn)在雄激素受體非依賴性的前列腺癌中,雄激素受體的信號(hào)與絲裂原活化蛋白激酶、雷帕霉素哺乳動(dòng)物靶蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制,使得多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有效的發(fā)揮其作用。臨床大量的研究發(fā)現(xiàn),相當(dāng)多數(shù)量的前列腺癌患者,經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)分泌治療16-24個(gè)月后,很容易演變?yōu)槿?shì)抵抗型前列腺癌,表現(xiàn)為雄激素剝奪不敏感,腫瘤惡性程度更高,而且臨床缺乏成熟的治療手段。對(duì)于晚期前列腺癌患者,目前尚無(wú)確切有效的治療措施,通常只能采取綜合的保守治療方法。近年來(lái),阿比特龍和恩雜魯胺的臨床研究帶來(lái)了一線生機(jī),但尚待上市后大規(guī)模臨床研究證實(shí)其價(jià)值。當(dāng)患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后,生存期通常不超過(guò)24個(gè)月。因此尋找高特異性前列腺癌標(biāo)記物,提高早期確診率,成為提高前列腺癌治療效果的關(guān)鍵。研究前列腺癌向CRPC轉(zhuǎn)化發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制,對(duì)于早期篩查和開(kāi)發(fā)靶向治療藥物等,都具有重大意義。最近涌現(xiàn)的基因芯片技術(shù)和蛋白組學(xué)技術(shù)等研究手段,為進(jìn)一步探索CRPC發(fā)生及發(fā)展提供了新的路線圖。AT富集序列特異性結(jié)合蛋白-1(Special AT rich sequence binding Protein-1, SATB-1)是一種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)結(jié)合蛋白,人類SATB-1基因定位于3號(hào)染色體3p23區(qū),全長(zhǎng)共763個(gè)氨基酸。1992年由Dickinson等使用免疫球蛋白重鏈μ鏈增強(qiáng)子核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MARs)為探針克隆出。SATB-1是一種基因調(diào)節(jié)因子,主要表達(dá)于胸腺細(xì)胞和前B細(xì)胞中,具有細(xì)胞類型特異性的核基質(zhì)結(jié)合域DNA結(jié)合蛋白。SATB-1通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)行為,從而抑制腫瘤形成或促進(jìn)腫瘤的生成。SATB-1基因表達(dá)的調(diào)節(jié),控制著多個(gè)細(xì)胞過(guò)程,包括細(xì)胞凋亡和增殖。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),SATB-1在眾多腫瘤發(fā)揮著重要作用,通過(guò)免疫調(diào)節(jié)、凋亡調(diào)控影響腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移主要是細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及侵襲的結(jié)果,在早期,癌細(xì)胞從鄰近細(xì)胞中逃離然后浸澗到周圍細(xì)胞層,這些腫瘤細(xì)胞會(huì)丟失細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏著,并獲得遷移能力。通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)上皮細(xì)胞獲得遷移能力。研究證實(shí)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可通過(guò)多種機(jī)制來(lái)促進(jìn)腫瘤侵襲和擴(kuò)散的級(jí)聯(lián)反應(yīng),是腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。新近的研究證據(jù)表明,SATB-1的過(guò)度表達(dá)下調(diào)鈣粘附蛋白E(E-cadherin)的基因表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT的進(jìn)一步發(fā)生。越來(lái)越多的證據(jù)表明,SATB-1與腫瘤侵襲能力和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,甚至導(dǎo)致腫瘤的不良預(yù)后。不過(guò)SATB-1是如何促進(jìn)腫瘤侵襲,以及如何導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制尚不清楚。SATB-1作為一種核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(Matrix Attachment Region, MAR)蛋白,通過(guò)與MAR序列結(jié)合,參與染色體重塑、核小體定位、調(diào)節(jié)基因表達(dá)以及組蛋白修飾等過(guò)程,并在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤轉(zhuǎn)移和凋亡方面具有重要的作用。新近的研究表明SATB-1在肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等組織中高度表達(dá),可能與腫瘤的進(jìn)展、預(yù)后不良等有密切相關(guān)。研究表明,SATB-1的表達(dá)可以在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)出明顯的基因表達(dá)的改變,從而使相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞變得更有侵襲性,從而在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)等過(guò)程中起了關(guān)鍵作用�；谝陨媳尘�,SATB-1被視為腫瘤研究領(lǐng)域的有價(jià)值的新靶點(diǎn)。然而,SATB-1促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制均尚不明確。在前列腺癌中SATB-1的表達(dá)情況和作用尚不清楚。本研究的目的是探討和評(píng)估SATB-1對(duì)前列腺癌生物學(xué)行為的影響,以及闡明該變化是否通過(guò)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞(EMT)轉(zhuǎn)化途徑實(shí)現(xiàn)。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)SATB-1在前列腺癌、及癌旁組織和典型前列腺細(xì)胞系中的表達(dá),探討其與前列腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移等特性的關(guān)系。本課題研究?jī)?nèi)容分三個(gè)部分第一部分：SATB-1在前列腺癌組織和前列腺細(xì)胞系中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究目的：通過(guò)本實(shí)驗(yàn)明確SATB-1在前列腺癌組織以及前列腺細(xì)胞系中的表達(dá)情況,為后續(xù)的研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)材料。方法：1)標(biāo)本收集：2010年12月和2014年11月間在南方醫(yī)科大學(xué)接受前列腺癌手術(shù)治療的98例患者的前列腺癌組織和癌旁組織。2)細(xì)胞系選用與細(xì)胞培養(yǎng)：前列腺癌PC3、LNCaP、22RV1細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas, USA),分別保存于RPMI1640溶液中,定期補(bǔ)充含10%(體積/體積)胎牛血清和抗生素。DU145細(xì)胞系使用改良伊格爾培養(yǎng)基,定期補(bǔ)充含10%(體積/體積)胎牛血清、2毫摩爾的L-谷氨酰胺和抗生素。人類非致瘤性前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),補(bǔ)充5毫微克/ml人重組表皮生長(zhǎng)因子和30mg/ml牛垂體提取物(Invitrogen,加利福尼亞州)。培養(yǎng)細(xì)胞系維持37℃,5%CO2的潮濕環(huán)境。3)免疫組化：對(duì)于SATB-1表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析,使用自動(dòng)切片,厚度4um,自動(dòng)染色系統(tǒng)預(yù)處理,用抗SATB-1抗體標(biāo)記(Abcam公司)。至少有1%癌細(xì)胞中出現(xiàn)任何強(qiáng)度的核陽(yáng)性,被認(rèn)為SATB-1陽(yáng)性表達(dá)。在任何原發(fā)性腫瘤或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞核陽(yáng)性病例被認(rèn)為是陽(yáng)性表達(dá),間質(zhì)淋巴細(xì)胞作為SATB-1的陽(yáng)性對(duì)照。4)RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定：根據(jù)試劑操作(Invitrogen, USA)的說(shuō)明,從冷凍組織樣品、細(xì)胞系,使用Trizol試劑提取總RNA并純化。定量RT-PCR使用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara, China)。在20微升的反應(yīng)體積中,從總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。反轉(zhuǎn)錄在37℃下進(jìn)行15分鐘,然后在85℃維持5秒。使用Power SYBR Green (Takara, China)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析。所有的操作均按照說(shuō)明要求完成,并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照。5)引物合成：引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司(上海,中國(guó))合成�；蛱禺愋砸餅镾ATB-1的序列(正向,5'GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3';反向,5'-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3')和GAPDH(正向,5'-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3';反向,5'-TGCCATGGGTGGAATCATATTGGA-3-')。使用ABI7500平臺(tái)進(jìn)行定量RT-PCR測(cè)定和數(shù)據(jù)收集,每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行分析。6) Western Blot印跡分析：使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞全蛋白提取試劑盒RIPA(碧云天),補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑混合物(Roche)和PMSF (Roche)的裂解產(chǎn)物。蛋白質(zhì)通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,并轉(zhuǎn)移至0.22毫米硝化纖維素(NC)或聚偏二氟乙烯膜上(Sigma).將膜洗滌、固定,并且與特定的初級(jí)抗人抗體溫育。SATB-1抗體購(gòu)自Abcam公司(Cambridge, USA),二級(jí)抗體是辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的羊抗兔IgG。底物顯色及條帶的強(qiáng)度通過(guò)Bio-Rad公司定量分析軟件進(jìn)行光密度測(cè)定的定量分析。結(jié)果：通過(guò)免疫組化檢查、定量RT-PCR和免疫印跡分析98對(duì)PCa的組織樣本和癌旁組織樣本的SATB-1的表達(dá)水平,比較后發(fā)現(xiàn),SATB-1的表達(dá)在癌組織與癌旁組織出現(xiàn)顯著上調(diào)。進(jìn)一步的觀察表明,SATB-1蛋白主要位于細(xì)胞核中。在77/98(78.57%)例前列腺癌病例中觀察到SATB-1的陽(yáng)性染色,在相鄰的癌旁組織標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)的比例為18/98(18.36%),但兩者有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。結(jié)論：定量RT-PCR和免疫印跡的結(jié)果表明,腫瘤組織比癌旁組織表現(xiàn)出更高水平的SATB-1 mRNA和蛋白質(zhì)。此外,我們研究了在前列腺細(xì)胞系以及永生化非致瘤性人前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1 SATB-1的表達(dá)。相比RWPE-1細(xì)胞系,SATB-1的mRNA和蛋白水平在所有人類前列腺癌細(xì)胞系大大升高。SATB-1的表達(dá)水平在不同前列腺細(xì)胞系之間有一定差異。第二部分：SATB-1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究目的：探討SATB-1對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響方法：1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：SATB-1表達(dá)載體選用pcDNA3.1,構(gòu)建沉默SATB-1的特異性shRNA pGenesil2-SATB-1,選用lipofectamin轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Invitrogen,USA).轉(zhuǎn)染后,孵育24小時(shí),然后用G418篩選(400毫克/毫升)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。其后,挑選穩(wěn)定的細(xì)胞單菌落,并在含有200毫克/毫升G418的培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng)。所有后續(xù)研究使用的穩(wěn)定細(xì)胞系均從單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。用pcDNA3.1或pGenesil2載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作陰性對(duì)照。2)MTT法：轉(zhuǎn)染成功后,將細(xì)胞在96孔板中用104細(xì)胞/孔的密度接種。此后,更換培養(yǎng)基,細(xì)胞用20微升的MTT (5mg/ml; Sigma)培養(yǎng)4小時(shí)。該混合物以12,000轉(zhuǎn)/min在4℃下進(jìn)行10分鐘離心。除去上清液,加入50微升的DMSO到每個(gè)孔中,并且將溶液攪拌均勻后上脫色搖床10分鐘。用酶免疫分析儀(BioTek)測(cè)定每個(gè)孔在490nm的光密度(OD)值。3)細(xì)胞增殖的抑制率(抑制率,IR)的計(jì)算如下：IR=(1-實(shí)驗(yàn)組的平均OD值/對(duì)照組的平均OD值)×100%。使用不同濃度的細(xì)胞增殖抑制率,計(jì)算50%抑制濃度(IC50)。結(jié)果：LNCaP細(xì)胞被用來(lái)建立SATB-1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系,并用DU145細(xì)胞系通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染,建立SATB-1沉默細(xì)胞系。SATB-1的過(guò)度表達(dá)(指LNCaP-SATB-1)和沉默SATB-1表達(dá)(指DU145-shSATB-1),細(xì)胞系中的表達(dá)水平通過(guò)qRT-PCR和Western印跡驗(yàn)證。在LNCaP-SATB-1細(xì)胞系,SATB-1 mRNA的定量RT-PCR顯示表達(dá)水平與對(duì)照組相比有顯著增加；蛋白質(zhì)印跡顯示SATB-1蛋白在LNCaP-SATB-1細(xì)胞中的表達(dá)顯著增高；與對(duì)照組相比,在DU145-shSAT SATB-1細(xì)胞系,mRNA的定量RT-PCR顯示表達(dá)水平顯著降低；蛋白質(zhì)印跡顯示DU145-shSAT SATB-1細(xì)胞系蛋白的表達(dá)降低顯著。結(jié)論：通過(guò)MTT研究表明,LNCaP-SATB-1細(xì)胞系與對(duì)照相比,細(xì)胞增殖顯著增加；與此相反,DU145-shSATB-1細(xì)胞系細(xì)胞增殖的比例較低。因此,研究認(rèn)為SATB-1表達(dá)影響前列腺細(xì)胞增殖。第三部分：SATB-1調(diào)控前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的實(shí)驗(yàn)研究目的：探討SATB-1對(duì)體外Transwell小室前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響方法：Transwell小侵襲實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)使用8毫米孔徑Transwell小室,將懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種到上部室,補(bǔ)充有10%FBS的置入下室。經(jīng)過(guò)24小時(shí)后,已通過(guò)膜表面侵入的細(xì)胞用甲醇固定,用結(jié)晶紫染色10分鐘,并計(jì)數(shù),測(cè)定侵襲結(jié)果。結(jié)果：進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)沉默SATB-1處理的DU145-細(xì)胞與LNCap SATB-1表達(dá)組相比,其遷移和侵襲能力顯著減少。pcDNA3.1載體空轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。結(jié)論：前列腺癌細(xì)胞系的體外研究證實(shí),在LNCaP細(xì)胞的SATB-1表達(dá),能促進(jìn)他們的遷移和侵襲能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：1771275