本文選題：SATB-1 + 前列腺癌��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：全國腫瘤登記中心的數(shù)據(jù)顯示,前列腺癌是近幾年來,中國大陸地區(qū)發(fā)病率逐年爬升的惡性腫瘤之一。隨著我國居民生活水平的提高和生活方式的改變,特別是近年來,人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)的變化,我國前列腺癌的發(fā)病率正呈現(xiàn)較快的上升趨勢,已躍居泌尿生殖男性系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位,仍有進一步升高的趨勢。因為前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen, PSA)等普查不夠普及,我國的初發(fā)即表現(xiàn)為晚期的前列腺癌患者比例遠高于西方國家,這一現(xiàn)象在農(nóng)村地區(qū)尤為突出。在我國,前列腺癌患者初診時常常已經(jīng)是腫瘤晚期,其中大約有40%的人已經(jīng)出現(xiàn)有局部或遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移,僅僅小于30%的患者有手術(shù)機會,導致我國前列腺癌患者的普遍預后較差。已有的各項研究表明,諸多危險因素參與了前列腺癌的發(fā)生和進展。盡管在前列腺癌基因水平的研究取得眾多新進展,但是轉(zhuǎn)移性前列腺癌的有效臨床治療仍然面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。進一步的解剖、病理、影像等研究發(fā)現(xiàn),當診斷為前列腺癌時,前列腺腫瘤細胞已經(jīng)侵犯到前列腺外科包膜,甚至發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。通過研究前列腺癌的發(fā)生原因、發(fā)展機制,并在此基礎(chǔ)上尋找前列腺癌的治療方法,成為泌尿外科領(lǐng)域的重要研究課題。PCa的發(fā)生是一個異常復雜的過程,諸多遺傳、種族、年齡、生活習慣、環(huán)境等因素與其相關(guān)：腫瘤的產(chǎn)生又經(jīng)過多個步驟和多個階段。早在1941年,Huggins等首先報告了前列腺癌的雄激素依賴,并采取外科去勢的方式治療前列腺癌,取得了明顯的治療療效。臨床通過手術(shù)或藥物去勢,同時使用雄激素受體括抗劑來降低體內(nèi)雄激素水平,完全性雄激素阻斷治療仍然是目前治療前列腺癌的重要方法。由于發(fā)生突變或者翻譯后的修飾,雄激素受體的功能缺失,最終導致細胞對雄激素產(chǎn)生耐受。近期的研究也發(fā)現(xiàn)在雄激素受體非依賴性的前列腺癌中,雄激素受體的信號與絲裂原活化蛋白激酶、雷帕霉素哺乳動物靶蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶等信號轉(zhuǎn)導通路間復雜的調(diào)節(jié)機制,使得多重信號轉(zhuǎn)導有效的發(fā)揮其作用。臨床大量的研究發(fā)現(xiàn),相當多數(shù)量的前列腺癌患者,經(jīng)過標準內(nèi)分泌治療16-24個月后,很容易演變?yōu)槿莸挚剐颓傲邢侔?表現(xiàn)為雄激素剝奪不敏感,腫瘤惡性程度更高,而且臨床缺乏成熟的治療手段。對于晚期前列腺癌患者,目前尚無確切有效的治療措施,通常只能采取綜合的保守治療方法。近年來,阿比特龍和恩雜魯胺的臨床研究帶來了一線生機,但尚待上市后大規(guī)模臨床研究證實其價值。當患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后,生存期通常不超過24個月。因此尋找高特異性前列腺癌標記物,提高早期確診率,成為提高前列腺癌治療效果的關(guān)鍵。研究前列腺癌向CRPC轉(zhuǎn)化發(fā)生和進展的分子機制,對于早期篩查和開發(fā)靶向治療藥物等,都具有重大意義。最近涌現(xiàn)的基因芯片技術(shù)和蛋白組學技術(shù)等研究手段,為進一步探索CRPC發(fā)生及發(fā)展提供了新的路線圖。AT富集序列特異性結(jié)合蛋白-1(Special AT rich sequence binding Protein-1, SATB-1)是一種組織特異性表達的核基質(zhì)結(jié)合蛋白,人類SATB-1基因定位于3號染色體3p23區(qū),全長共763個氨基酸。1992年由Dickinson等使用免疫球蛋白重鏈μ鏈增強子核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MARs)為探針克隆出。SATB-1是一種基因調(diào)節(jié)因子,主要表達于胸腺細胞和前B細胞中,具有細胞類型特異性的核基質(zhì)結(jié)合域DNA結(jié)合蛋白。SATB-1通過多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤的生物學行為,從而抑制腫瘤形成或促進腫瘤的生成。SATB-1基因表達的調(diào)節(jié),控制著多個細胞過程,包括細胞凋亡和增殖。近年來的研究發(fā)現(xiàn),SATB-1在眾多腫瘤發(fā)揮著重要作用,通過免疫調(diào)節(jié)、凋亡調(diào)控影響腫瘤的發(fā)生、進展及轉(zhuǎn)移。腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移主要是細胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及侵襲的結(jié)果,在早期,癌細胞從鄰近細胞中逃離然后浸澗到周圍細胞層,這些腫瘤細胞會丟失細胞與細胞之間的黏著,并獲得遷移能力。通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)上皮細胞獲得遷移能力。研究證實上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可通過多種機制來促進腫瘤侵襲和擴散的級聯(lián)反應(yīng),是腫瘤發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。新近的研究證據(jù)表明,SATB-1的過度表達下調(diào)鈣粘附蛋白E(E-cadherin)的基因表達,進而促進腫瘤細胞EMT的進一步發(fā)生。越來越多的證據(jù)表明,SATB-1與腫瘤侵襲能力和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,甚至導致腫瘤的不良預后。不過SATB-1是如何促進腫瘤侵襲,以及如何導致腫瘤轉(zhuǎn)移的確切機制尚不清楚。SATB-1作為一種核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(Matrix Attachment Region, MAR)蛋白,通過與MAR序列結(jié)合,參與染色體重塑、核小體定位、調(diào)節(jié)基因表達以及組蛋白修飾等過程,并在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤轉(zhuǎn)移和凋亡方面具有重要的作用。新近的研究表明SATB-1在肺癌細胞、乳腺癌細胞等組織中高度表達,可能與腫瘤的進展、預后不良等有密切相關(guān)。研究表明,SATB-1的表達可以在腫瘤細胞中誘導出明顯的基因表達的改變,從而使相應(yīng)的腫瘤細胞變得更有侵襲性,從而在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)等過程中起了關(guān)鍵作用。基于以上背景,SATB-1被視為腫瘤研究領(lǐng)域的有價值的新靶點。然而,SATB-1促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的確切機制均尚不明確。在前列腺癌中SATB-1的表達情況和作用尚不清楚。本研究的目的是探討和評估SATB-1對前列腺癌生物學行為的影響,以及闡明該變化是否通過上皮細胞-間充質(zhì)細胞(EMT)轉(zhuǎn)化途徑實現(xiàn)。本研究旨在通過檢測SATB-1在前列腺癌、及癌旁組織和典型前列腺細胞系中的表達,探討其與前列腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移等特性的關(guān)系。本課題研究內(nèi)容分三個部分第一部分：SATB-1在前列腺癌組織和前列腺細胞系中表達的實驗研究目的：通過本實驗明確SATB-1在前列腺癌組織以及前列腺細胞系中的表達情況,為后續(xù)的研究提供形態(tài)學依據(jù)和實驗材料。方法：1)標本收集：2010年12月和2014年11月間在南方醫(yī)科大學接受前列腺癌手術(shù)治療的98例患者的前列腺癌組織和癌旁組織。2)細胞系選用與細胞培養(yǎng)：前列腺癌PC3、LNCaP、22RV1細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas, USA),分別保存于RPMI1640溶液中,定期補充含10%(體積/體積)胎牛血清和抗生素。DU145細胞系使用改良伊格爾培養(yǎng)基,定期補充含10%(體積/體積)胎牛血清、2毫摩爾的L-谷氨酰胺和抗生素。人類非致瘤性前列腺上皮細胞系RWPE-1在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),補充5毫微克/ml人重組表皮生長因子和30mg/ml牛垂體提取物(Invitrogen,加利福尼亞州)。培養(yǎng)細胞系維持37℃,5%CO2的潮濕環(huán)境。3)免疫組化：對于SATB-1表達的免疫組織化學分析,使用自動切片,厚度4um,自動染色系統(tǒng)預處理,用抗SATB-1抗體標記(Abcam公司)。至少有1%癌細胞中出現(xiàn)任何強度的核陽性,被認為SATB-1陽性表達。在任何原發(fā)性腫瘤或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的細胞核陽性病例被認為是陽性表達,間質(zhì)淋巴細胞作為SATB-1的陽性對照。4)RNA提取和實時定量PCR測定：根據(jù)試劑操作(Invitrogen, USA)的說明,從冷凍組織樣品、細胞系,使用Trizol試劑提取總RNA并純化。定量RT-PCR使用隨機引物和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara, China)。在20微升的反應(yīng)體積中,從總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。反轉(zhuǎn)錄在37℃下進行15分鐘,然后在85℃維持5秒。使用Power SYBR Green (Takara, China)系統(tǒng)的標準流程進行實時定量RT-PCR分析。所有的操作均按照說明要求完成,并進行標準化對照。5)引物合成：引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司(上海,中國)合成�；蛱禺愋砸餅镾ATB-1的序列(正向,5'GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3';反向,5'-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3')和GAPDH(正向,5'-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3';反向,5'-TGCCATGGGTGGAATCATATTGGA-3-')。使用ABI7500平臺進行定量RT-PCR測定和數(shù)據(jù)收集,每個樣品一式三份進行分析。6) Western Blot印跡分析：使用哺乳動物細胞全蛋白提取試劑盒RIPA(碧云天),補充有蛋白酶抑制劑混合物(Roche)和PMSF (Roche)的裂解產(chǎn)物。蛋白質(zhì)通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,并轉(zhuǎn)移至0.22毫米硝化纖維素(NC)或聚偏二氟乙烯膜上(Sigma).將膜洗滌、固定,并且與特定的初級抗人抗體溫育。SATB-1抗體購自Abcam公司(Cambridge, USA),二級抗體是辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗兔IgG。底物顯色及條帶的強度通過Bio-Rad公司定量分析軟件進行光密度測定的定量分析。結(jié)果：通過免疫組化檢查、定量RT-PCR和免疫印跡分析98對PCa的組織樣本和癌旁組織樣本的SATB-1的表達水平,比較后發(fā)現(xiàn),SATB-1的表達在癌組織與癌旁組織出現(xiàn)顯著上調(diào)。進一步的觀察表明,SATB-1蛋白主要位于細胞核中。在77/98(78.57%)例前列腺癌病例中觀察到SATB-1的陽性染色,在相鄰的癌旁組織標本中陽性表達的比例為18/98(18.36%),但兩者有顯著統(tǒng)計學意義(P0.001)。結(jié)論：定量RT-PCR和免疫印跡的結(jié)果表明,腫瘤組織比癌旁組織表現(xiàn)出更高水平的SATB-1 mRNA和蛋白質(zhì)。此外,我們研究了在前列腺細胞系以及永生化非致瘤性人前列腺上皮細胞系RWPE-1 SATB-1的表達。相比RWPE-1細胞系,SATB-1的mRNA和蛋白水平在所有人類前列腺癌細胞系大大升高。SATB-1的表達水平在不同前列腺細胞系之間有一定差異。第二部分：SATB-1促進前列腺癌細胞增殖的實驗研究目的：探討SATB-1對前列腺癌細胞增殖的影響方法：1)細胞轉(zhuǎn)染：SATB-1表達載體選用pcDNA3.1,構(gòu)建沉默SATB-1的特異性shRNA pGenesil2-SATB-1,選用lipofectamin轉(zhuǎn)染細胞(Invitrogen,USA).轉(zhuǎn)染后,孵育24小時,然后用G418篩選(400毫克/毫升)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。其后,挑選穩(wěn)定的細胞單菌落,并在含有200毫克/毫升G418的培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)。所有后續(xù)研究使用的穩(wěn)定細胞系均從單菌落進行培養(yǎng)。用pcDNA3.1或pGenesil2載體轉(zhuǎn)染的細胞作陰性對照。2)MTT法：轉(zhuǎn)染成功后,將細胞在96孔板中用104細胞/孔的密度接種。此后,更換培養(yǎng)基,細胞用20微升的MTT (5mg/ml; Sigma)培養(yǎng)4小時。該混合物以12,000轉(zhuǎn)/min在4℃下進行10分鐘離心。除去上清液,加入50微升的DMSO到每個孔中,并且將溶液攪拌均勻后上脫色搖床10分鐘。用酶免疫分析儀(BioTek)測定每個孔在490nm的光密度(OD)值。3)細胞增殖的抑制率(抑制率,IR)的計算如下：IR=(1-實驗組的平均OD值/對照組的平均OD值)×100%。使用不同濃度的細胞增殖抑制率,計算50%抑制濃度(IC50)。結(jié)果：LNCaP細胞被用來建立SATB-1過表達的細胞系,并用DU145細胞系通過病毒轉(zhuǎn)染,建立SATB-1沉默細胞系。SATB-1的過度表達(指LNCaP-SATB-1)和沉默SATB-1表達(指DU145-shSATB-1),細胞系中的表達水平通過qRT-PCR和Western印跡驗證。在LNCaP-SATB-1細胞系,SATB-1 mRNA的定量RT-PCR顯示表達水平與對照組相比有顯著增加；蛋白質(zhì)印跡顯示SATB-1蛋白在LNCaP-SATB-1細胞中的表達顯著增高；與對照組相比,在DU145-shSAT SATB-1細胞系,mRNA的定量RT-PCR顯示表達水平顯著降低；蛋白質(zhì)印跡顯示DU145-shSAT SATB-1細胞系蛋白的表達降低顯著。結(jié)論：通過MTT研究表明,LNCaP-SATB-1細胞系與對照相比,細胞增殖顯著增加；與此相反,DU145-shSATB-1細胞系細胞增殖的比例較低。因此,研究認為SATB-1表達影響前列腺細胞增殖。第三部分：SATB-1調(diào)控前列腺癌細胞遷移和侵襲的實驗研究目的：探討SATB-1對體外Transwell小室前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響方法：Transwell小侵襲實驗：細胞侵襲實驗使用8毫米孔徑Transwell小室,將懸浮于無血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染后細胞接種到上部室,補充有10%FBS的置入下室。經(jīng)過24小時后,已通過膜表面侵入的細胞用甲醇固定,用結(jié)晶紫染色10分鐘,并計數(shù),測定侵襲結(jié)果。結(jié)果：進行遷移和侵襲實驗研究結(jié)果表明,經(jīng)過沉默SATB-1處理的DU145-細胞與LNCap SATB-1表達組相比,其遷移和侵襲能力顯著減少。pcDNA3.1載體空轉(zhuǎn)染組和對照組之間無顯著差異。結(jié)論：前列腺癌細胞系的體外研究證實,在LNCaP細胞的SATB-1表達,能促進他們的遷移和侵襲能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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本文編號：1771275