本文選題：弓形蟲 + 致密顆粒蛋白GRA15　； 參考：《安徽醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景:肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,死亡率位于第二位。近年來腫瘤的免疫治療(immunotherapy),即通過打破機體或腫瘤局部的免疫耐受或免疫抑制,來提高機體自身的免疫功能,已成為“帶瘤生存”新理念和治療的重要手段之一。腫瘤免疫療法能夠激活機體免疫系統(tǒng),重建正常的免疫預警功能,具有靶向性強、毒副作用低、可產(chǎn)生免疫記憶等優(yōu)點。在腫瘤的炎癥微環(huán)境中,浸潤于腫瘤間質(zhì)中的巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。已有研究顯示,經(jīng)典途徑激活巨噬細胞(M1型)具有較高的抗原遞呈能力,發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)和細胞毒作用,而替代活化途徑獲得的巨噬細胞(M2型)具有較弱的抗原遞呈能力,參與負向免疫調(diào)節(jié)。剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種機會致病性的專性有核細胞內(nèi)寄生原蟲。廣泛分布在北美和歐洲的弓形蟲主要包括Ⅰ型蟲株(如RH株、GT1株等),Ⅱ型蟲株(如PRU株、ME49株等)以及Ⅲ型蟲株(如CTG株等)。機體在抗弓形蟲感染過程中,作為第一道屏障,Mφ與弓形蟲感染、增殖和播散密切相關。已有研究發(fā)現(xiàn)不同基因型的蟲株誘導機體內(nèi)Mφ向不同的方向偏移(bias),甚至極化(polarization),其中多態(tài)效應分子GRA15在感染早期即可直接激活宿主細胞的NF-κB,驅(qū)動Mφ向M1極化,在宿主固有免疫中發(fā)揮重要作用,同時也誘導Th1型免疫應答。目的:探討弓形蟲效應分子GRA15II誘導經(jīng)典途徑活化的巨噬細胞(M1)逆轉(zhuǎn)小鼠肝癌微環(huán)境中的TAMs從M2向M1極化,抑制腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,旨在為腫瘤免疫治療提供新思路和新策略。方法:從Ⅱ型弓形蟲PRU株中提取總RNA,擴增多態(tài)性GRA15II編碼基因,構建重組質(zhì)粒p EGFP-gra15II。體外將質(zhì)粒亞克隆入慢病毒載體并感染小鼠細胞系RAW264.7,使之誘導為M1。體外分別將Lv-gra15Ⅱ-Mφ(A組),空白病毒載體Lv-Mφ(B組)和未感染Mφ(C組)與小鼠肝癌細胞系Hepa1-6進行transwell共培養(yǎng),觀察上述三組Hepa1-6的增殖、遷移和侵襲能力,以及MMP-9和MMP-2表達。體內(nèi)實驗,取75只SPF級4-5w齡雌性C57/BL6小鼠,右腹股溝皮下接種Hepa1-6成瘤。3d后隨機分為3組,每組25只。A組為在小鼠皮下接種成瘤后3d和5d,分別經(jīng)尾靜脈給予重懸于150μl生理鹽水的2×106 Lv-gra15Ⅱ-Mφ;B組給予重懸于150μl生理鹽水的2×106 Lv-Mφ;C組給予150μl生理鹽水。在皮下注射成瘤10d后無痛處死小鼠。追蹤荷瘤鼠體內(nèi)輸入的巨噬細胞;觀察輸入的巨噬細胞對脾臟的影響;剝離腫瘤組織,觀察實體瘤體積;免疫組化檢測腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)浸潤和免疫抑制因子及血管生成相關因子的表達;瘤體q RT-PCR檢測i NOS、TGF-β、VEGF、IL-6和IL-10表達;ELISA檢測IL-6水平的變化。結(jié)果:GRA15II體外可驅(qū)動RAW264.7向M1方向極化。FCM、細胞培養(yǎng)上清和q RT-PCR檢測結(jié)果均顯示,相比于Lv-Mφ和Mφ,Lv-gra15Ⅱ-Mφ的PD-L1、CD80、NO、TNF-α、IL-12p40和i NOS表達有顯著升高(P0.05)。體內(nèi)試驗TAMs檢測結(jié)果,Lv-gra15Ⅱ-Mφ可減輕TAMs浸潤,并且使其向M1方向偏移,抑制腫瘤的增生。冰凍切片的結(jié)果顯示,輸入的巨噬細胞循環(huán)至實體瘤內(nèi),且至少存活72h。實體瘤免疫組化分析顯示,A組TAMs浸潤顯著減少(P0.05),IL-10和TGF-β及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達下調(diào),而MHC II表達增加。q RT-PCR檢測顯示A組小鼠實體瘤中i NOS表達明顯增加(P0.05),而TGF-β、VEGF、IL-6和IL-10表達下調(diào)。ELISA檢測顯示A組瘤體內(nèi)的IL-6分泌顯著下調(diào)(P0.05)。脾臟冰凍切片檢查見到,輸入的活化巨噬細胞通過調(diào)節(jié)全身的免疫力來對抗腫瘤生長。脾臟的TNF-α(P0.01),IL-12(P0.05)在m RNA轉(zhuǎn)錄水平升高,相反IL-6(P0.01)和IL-10(P0.01)在m RNA轉(zhuǎn)錄水平降低。體外共培養(yǎng)實驗顯示,Lv-gra15Ⅱ-Mφ可抑制小鼠肝癌細胞Hepa1-6遷移、侵襲,可下調(diào)其外基質(zhì)相關蛋白的分泌,而對Hepa1-6凋亡無影響。q RT-PCR和蛋白水平檢測均顯示A組與B組和C組比較,MMP-9和MMP-2表達顯著下調(diào)(P0.05)。結(jié)論:以上研究結(jié)果表明,弓形蟲效應分子Toxo GRA15II可以誘導巨噬細胞向經(jīng)典途徑方向極化,進一步通過調(diào)節(jié)腫瘤和脾臟中相關細胞因子的表達來限制腫瘤的發(fā)展。此外,由于Toxo GRA15II針對特定細胞群的激活并且對哺乳動物無毒,在增強宿主抗腫瘤先天性免疫和腫瘤的免疫治療方面具有潛在價值,值得深入研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1769199