發(fā)布時間：2018-04-18 07:19

  本文選題：BDE-209 + TR��； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：濾泡上皮細胞起源的甲狀腺癌(TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,城市女性第五位常見惡性腫瘤,近40年來呈明顯增長趨勢,其中以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroidcarcinoma,PTC)最常見。PTC的發(fā)生與碘過量、甲狀腺激素(thyroid hormone,TH)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡等有關(guān)。經(jīng)典型PTC五年生存率高達95%,但高危亞型PTC以及甲狀腺濾泡癌、低分化癌、未分化癌,具有較高復(fù)發(fā)率和死亡率。該類病變多伴有BRAFV600E基因突變,預(yù)后相對較差,術(shù)后激素抑制和I131治療效果較差而容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,新型PTC致癌基因和信號通路的鑒定和機制研究將為制定更加完善的個體化治療方案提供堅實的理論依據(jù)。十溴聯(lián)苯醚(Decabromodi-phenyl ether,BDE-209)是一種溴化的阻燃劑,被稱為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)廣泛應(yīng)用于家用電器、家具、紡織品中,由于PBDEs不與基質(zhì)材料形成化學(xué)鍵,容易從產(chǎn)品中逸出而進入環(huán)境。BDE-209結(jié)構(gòu)與三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)和甲狀腺素(thyroxine,T4)及多氯聯(lián)苯醚(polychlorinated biphenyls,PCBs)非常相似(圖1)。有報道稱雌激素代謝異常與甲狀腺乳頭狀癌(PTC)發(fā)病相關(guān),而研究表明,BDE-209無擬雌激素和抗雌激素活性。研究表明BDE-209可分解為小分子化合物,并且在哺乳動物體內(nèi)具有毒性持久性,生物累積效應(yīng),內(nèi)分泌毒性甚至實驗動物的致癌性。BDE-209可能作為一種TH類似物,通過作用于甲狀腺激素受體(thyroxine receptor,TR)干擾TH的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。國內(nèi)也有研究推斷BDE-209可能干擾TH轉(zhuǎn)運過程中的兩個重要蛋白TBG和TH轉(zhuǎn)運結(jié)合蛋白TTR,從而影響結(jié)合態(tài)T3的分離、FT4的脫碘過程,使血清T4降低并通過負反饋作用導(dǎo)致TSH升高。本課題擬在利用體內(nèi)外實驗和臨床標(biāo)本的檢測,篩選出BDE-209誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤發(fā)生的靶基因,深入探討B(tài)DE-209調(diào)控TR信號通路的分子生物學(xué)機制及其在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),BDE-209顯著促進人正常甲狀腺濾泡上皮細胞、甲狀腺癌細胞的增殖和遷移,并伴有甲狀腺激素受體TR的降低;移植瘤動物模型實驗顯示,BDE-209可以促進腫瘤的生長和浸潤;3例甲狀腺疾病患者和一例正常人血液中均檢測出BDE-209,其中PTC病例BDE-209濃度最高,而TR偏低;因而,我們推測BDE-209可能通過調(diào)節(jié)TR、促進細胞增殖和遷移等參與甲狀腺癌的發(fā)生與進展。本研究擬通過細胞學(xué)模型、動物模型分析BDE-209與甲狀腺病變及其基因?qū)W改變的關(guān)系,探索其誘導(dǎo)PTC發(fā)生的致瘤機制,為臨床靶向治療提供實驗依據(jù),為臨床靶向治療藥物的設(shè)計和選擇提供新的靶點和思路。第一部分BDE-209在正常人甲狀腺濾泡上皮細胞及具有不同基因背景的甲狀腺癌細胞系增殖、凋亡中的研究方法1.分別復(fù)蘇并培養(yǎng)正常人甲狀腺濾泡上皮細胞Nthy-ori 3-1以及具有不同基因背景的甲狀腺癌細胞系BHP10-3(甲狀腺乳頭狀癌PTC,伴RET/PTC1基因突變);IHH4(甲狀腺乳頭狀癌PTC,伴BRAFV600E基因突變);BCPAP(甲狀腺乳頭狀癌PTC,伴BRAFV600E基因突變);8505c(間變性甲狀腺癌ATC,伴BRAFV600E基因突變);TT2609(甲狀腺濾泡癌FTC)。2.不同濃度 BDE-209(0.08umol/l、0.16 umol/l、0.32 umol/l、0.64 umol/l、1.25 umol/l、2.50 umol/l)分別染毒 Nthy-ori 3-124h,48h,72h,以未加藥組細胞為對照組,MTS法檢測BDE-209染毒后細胞的增殖率,檢測細胞增殖活性。3.依據(jù)MTS檢測結(jié)果繪制生長曲線,選取3個時間段中與IC50值接近的兩個BDE-209濃度梯度(1.25 umol/l、2.50 umol/l)作為后續(xù)實驗濃度。4.以選取的BDE-209濃度分別對具有不同基因背景的甲狀腺癌細胞進行三個時間段的染毒處理,MTS法檢測藥物處理后各甲狀腺癌細胞的增殖率及增殖活性。5.檢測細胞凋亡和周期;實時定量熒光PCR法(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR),以選取濃度梯度 BDE-209(1.25umol/l,2.50 umol/l)染毒細胞72h后,檢測細胞周期蛋白(cyclinA2、cyclinD1)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的表達;以及濃度梯度BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)分別染毒處理各細胞系48h后,使用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(Western Blot)方法檢測cyclinA2、cyclinD1在蛋白水平的變化。結(jié)果1.MTS細胞增殖實驗結(jié)果顯示:在24h時,正常人甲狀腺濾泡上皮細胞Nthy ori3-1在不同濃度BDE-209染毒下的增殖具有趨勢;在48h和72h不同濃度下的BDE-209染毒后Nthy ori3-1細胞增殖率變化明顯,增殖效應(yīng)在2.50umol/l濃度下達到最大值20%。此三組實驗說明了 BDE-209促進人正常甲狀腺濾泡上皮細胞增殖,且主要以慢性毒性為主,該作用具有明顯的時間依賴性和劑量(0.08umol/l-2.50umol/l)依賴性。2.以選取的濃度梯度BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒具有不同基因背景的癌細胞,發(fā)現(xiàn):BDE-209促進甲狀腺癌細胞增殖,在乳頭狀癌(BHP10-3,BCPAP,IHH4)、間變性癌(8505C)中較濾泡癌(TT2609)中明顯,且BDE-209對甲狀腺癌細胞的作用以慢性毒性為主,具有時間和劑量依賴性。3.流式細胞術(shù)(flow cytometry)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示:在濃度梯度下,BDE-209染毒后,可以明顯抑制正常人甲狀腺濾泡上皮細胞及各甲狀腺癌細胞的凋亡,其抑制凋亡作用具有統(tǒng)計學(xué)意義。4.流式細胞術(shù)(flow cytometry)檢測細胞周期實驗結(jié)果顯示:BDE-209染毒后的正常人甲狀腺濾泡上皮細胞G1期明顯降低,但不具有統(tǒng)計學(xué)意義,而S期升高明顯,具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義;在甲狀腺癌細胞中,甲狀腺濾泡性癌TT2609(FTC)和間變性甲狀腺癌8505c(ATC),G1期明顯降低,,S期顯著升高,具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義;在甲狀腺乳頭狀癌細胞系IHH4(PTC)中,G1期明顯降低,,S期顯著升高,具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義;而在甲狀腺乳頭狀癌BCPAP(PTC)和BHP10-3(PTC)中,雖然G1期明顯降低,S期明顯升高,但都不具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有細胞的細胞周期檢測結(jié)果均顯示,S期的細胞比率(S-phase Fraction,SPF=S/(G0/G1+S+G2/M))升高,因此表明細胞的增殖率/增殖活性升高,提示正常細胞存在惡性轉(zhuǎn)化的傾向。5.qRT-PCR 和 Western Blot 結(jié)果顯示,濃度梯度 BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒后的正常人甲狀腺濾泡上皮細胞Nthy ori3-l及所有甲狀腺癌細胞的細胞周期蛋白cyclinA2、cyclinD1在mRNA水平和蛋白水平顯著升高。結(jié)論1.BDE-209促進正常人甲狀腺濾泡上皮細胞和所有甲狀腺癌細胞增殖,具有時間依賴性和劑量依賴性。2.BDE-209通過調(diào)控細胞周期蛋白cyclinA2、cyclinD1提高細胞周期S期的比例,同時G1期比例降低,從而促進正常人甲狀腺濾泡上皮細胞和所有甲狀腺癌細胞的增殖,促進細胞惡性轉(zhuǎn)化行為。第二部分BDE-209染毒后影響正常人甲狀腺濾泡上皮細胞遷移能力、甲狀腺癌細胞侵襲、遷移以及甲狀腺激素受體表達量的檢測方法1.選取高濃度2.50umol/l的BDE-209培養(yǎng)染毒正常人甲狀腺濾泡上皮細胞Nthy ori3-1進行劃痕實驗檢測正常細胞的遷移能力。2.2.50umol/l的BDE-209染毒甲狀腺癌細胞,進行transwell小室實驗,檢測癌細胞的遷移和侵襲能力。3.實時定量熒光 PCR 法(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR),檢測BDE-209(1.25umol/l,2.50 umol/l)染毒細胞72h后甲狀腺激素受體(TRα、TRβ)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA 的表達;以及 BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒細胞48h后,蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(Western Blot)方法檢測TRα、TRβ在蛋白水平的變化。結(jié)果1.正常人甲狀腺濾泡上皮細胞染毒BDE-209劃痕實驗顯示:BDE-209作用后的Nthy ori3-1細胞具有遷移能力。2.Transwell小室實驗顯示:甲狀腺癌細胞經(jīng)BDE-209染毒后侵襲和遷移能力均增強,具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。3.qRT-PCR 和 Western Blot 結(jié)果顯示,濃度梯度 BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒后的正常人甲狀腺濾泡上皮細胞Nthy ori3-1及所有甲狀腺癌細胞的TRα、TRβ表達在mRNA水平和蛋白水平顯著升高。結(jié)論1.BDE-209影響正常人甲狀腺濾泡上皮細胞的遷移能力,促使正常甲狀腺濾泡上皮細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。2.BDE-209促進甲狀腺癌細胞侵襲、遷移能力,使癌細胞的惡性程度增加。3.BDE-209可能通過負向調(diào)控甲狀腺激素受體TR α、TRβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進而影響正常人甲狀腺濾泡上皮細胞惡性行為轉(zhuǎn)化及促使甲狀腺癌細胞惡性程度增加。第三部分BDE-209染毒BALB/c雌性裸鼠皮下成瘤和尾靜脈移植瘤動物模型預(yù)實驗方法1.篩選并培養(yǎng)致瘤細胞BCPAP(甲狀腺乳頭狀癌PTC,伴BRAFV600E基因突變)。5周齡大小BALB/c雌性裸鼠隨機進行分組,每組5只:隨機分成對照組(花生油組)和BDE-209超高劑量組(2000ug/(kg · d))。每只BALB/c裸鼠以終體積 0.2ml PBS(phosphate buffered saline),細胞計數(shù)為 2.0×106,制成細胞懸液注射于裸鼠兩側(cè)腋前皮下,腫瘤生成后每兩日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤瘤體長徑與短徑,直至實驗結(jié)束,繪制成裸鼠腫瘤體積指數(shù)曲線;同時,當(dāng)腫瘤瘤體長徑≥0.4cm(約7天)時,開始用超高劑量BDE-2092000ug/(kg·d)隔天灌胃一次,并同時測量腫瘤大小,每第二次測量腫瘤大小同時稱量裸鼠體重并記錄,直到實驗結(jié)束,繪制裸鼠體重指數(shù)曲線。觀察各組小鼠腫瘤形成情況及對照組與實驗組之間腫瘤瘤體大小、體重變化的差別。2.實驗結(jié)束后,分別留取實驗組和對照組裸鼠的外周全血靜置0.5h后,5000rpm離心20分鐘收取上層血清,放-80℃保存或者立即實驗室檢測甲狀腺功能(FT3、FT4、T3、T4、TSH、TR),對比分析。3.用0.1%戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠,分別取實驗組和對照組裸鼠相關(guān)組織(腫瘤、甲狀腺、肝、脾)稱重,計算并比較各組織重量指數(shù),繪制成重量指數(shù)曲線。4.將上一步驟中取下的實驗組和對照組裸鼠的各組織分為兩份,一份石蠟包埋,制作HE切片進行病理形態(tài)學(xué)觀察,分析實驗組和對照組裸鼠組織形態(tài)學(xué)上存在的差別;另一份新鮮組織液氮罐內(nèi)凍存,用于組織RNA提取、總蛋白提取。5.5周齡大小BALB/c雌性裸鼠2只,以終體積0.2ml PBS,細胞計數(shù)為1.0×107,制成細胞懸液經(jīng)尾靜脈注射,觀察裸鼠狀態(tài)。結(jié)果1.持續(xù)實驗過程中觀察到:隨著實驗進展,實驗組裸鼠攝食、飲水量較對照組少;活動度降低;裸鼠皮膚褶皺明顯增多,皮膚顏色呈現(xiàn)暗褐色甚至黑褐色。2.實驗組裸鼠腫瘤體積與對照組相比,初期差別不明顯,隨著實驗進展,實驗組裸鼠體腫瘤體積明顯大于對照組。3.實驗組裸鼠體重變化與對照組相比較,實驗前期,兩組裸鼠體重均呈現(xiàn)增加趨勢,但實驗組裸鼠體重增加指數(shù)明顯低于對照組;實驗中后期,實驗組與對照組裸鼠體重均呈現(xiàn)下降趨勢,且實驗組裸鼠體重降低指數(shù)明顯超過對照組。4.在實驗過程中,BDE-209灌胃組小鼠飲食量、飲水量較對照組明顯降低;實驗后期,實驗組小鼠狀態(tài)明顯差于對照組,且皮膚顏色呈現(xiàn)藍黑色。5.血清檢測甲狀腺功能由于裸鼠血液提取量低,結(jié)果未測得。6.尾靜脈裸鼠于實驗第7天開始出現(xiàn)體重下降,飲食、飲水量下降,精神狀態(tài)下降,皮膚顏色呈現(xiàn)暗褐色,且變化時間早于實驗組小鼠,裸鼠于實驗第14天發(fā)生死亡。結(jié)論1.BDE-209可以加速皮下移植瘤的生長速度,促進甲狀腺癌細胞的惡性進展。2.BDE-209影響小鼠行為學(xué)和精神狀態(tài)改變。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R736.1

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本文編號：1767335