本文選題：功能化石墨烯 + DNA　； 參考：《重慶大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：隨著工業(yè)化進(jìn)程日益加快,環(huán)境污染日漸嚴(yán)重以及人口老齡化不斷加速,惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率也在快速攀升,已然成為威脅人類健康的頭號殺手。因為惡性腫瘤的早期患者所治愈的可能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于晚期患者,而且要節(jié)省更多的財力、人力和時間,倘若腫瘤發(fā)生能夠及時被檢測,這對于提高腫瘤治愈率和延長患者生存期具有重要的臨床意義。隨著對基因結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入,人們逐漸發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤等重大疾病都與遺傳基因有關(guān)。基因DNA分子的結(jié)構(gòu)序列發(fā)生微小改變,都會導(dǎo)致遺傳信息的改變或疾病的發(fā)生。通過對與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因序列檢測,對腫瘤的早期診斷、監(jiān)測和治療方面具有重要臨床應(yīng)用價值�；诩{米技術(shù)、生物傳感技術(shù)和電化學(xué)分析技術(shù),本研究構(gòu)建了一系列在腫瘤早期篩查和診斷中具有重要應(yīng)用前景的高靈敏電化學(xué)DNA生物傳感器。從功能化石墨烯納米材料的制備,傳感器敏感界面的構(gòu)建以及新型信號增強(qiáng)的DNA傳感器的研制,并研究新方法及其應(yīng)用等方面進(jìn)行了探索和研究,為惡性腫瘤的早期檢測以及相關(guān)研究提供新的思路。本論文主要開展的工作及結(jié)果如下:(1)基于GO-COOH/Cu O NWs構(gòu)建的DNA生物傳感器對肺癌相關(guān)基因CYFRA21-1的檢測制備羧基功能化石墨烯(GO-COOH)以改善r GO的分散性和生物相容性,再合成氧化銅納米線(Cu O NWs),并充分結(jié)合二者的優(yōu)勢,通過簡單的混合使其相互交織纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),這種方法避免了將兩者進(jìn)行復(fù)合的繁瑣合成步驟,且復(fù)合物中的Cu O NWs充當(dāng)電子傳遞“導(dǎo)線”,能夠促進(jìn)電極的電子傳遞速率。對所制備的GO-COOH/Cu O NWs復(fù)合材料進(jìn)行SEM、TEM、EDX和FTIR表征和電化學(xué)性能測試。將5’端修飾有-NH2的CYFRA21-1探針分子通過酰胺共價固定到GO-COOH/Cu O NWs工作電極表面。采用MB做雜交指示劑,利用ss DNA/GO-COOH/Cu O NWs/PLLy/GCE構(gòu)建的電化學(xué)DNA傳感器對CYFRA21-1基因的人工合成序列進(jìn)行檢測。研究結(jié)果表明該傳感器在1.0×10-6~1.0×10 12 mol/L的濃度范圍內(nèi)與電化學(xué)響應(yīng)信號呈良好線性關(guān)系,以及良好的選擇性和穩(wěn)定性。(2)構(gòu)建NG/Au NPs DNA生物傳感器并檢測HL-60人原髓白血病細(xì)胞的MDR1基因采用元素?fù)诫s的方法進(jìn)一步改善石墨烯的電化學(xué)活性。對GO進(jìn)行N原子摻雜,再將Au3+原位還原到NG中,從而得到NG/Au NPs復(fù)合材料,再利用強(qiáng)烈的S-Au鍵將巰基修飾的MDR1基因探針固定在傳感器NG/Au NPs修飾電極表面。利用SEM、TEM、XRD和XPS對材料的理化特性進(jìn)行了表征�；贜G/Au NPs的優(yōu)異的電催化能力和生物相容性,構(gòu)建的電化學(xué)DNA傳感器對MDR1基因人工合成序列的最低檢出限為3.12×10-15 mol/L。構(gòu)建的DNA生物傳感器在腫瘤實際樣品檢測中進(jìn)行了初步應(yīng)用。利用構(gòu)建的NG/Au NPs DNA生物傳感器檢測HL-60人原髓白血病細(xì)胞的MDR1基因的RT-PCR產(chǎn)物,并將實驗結(jié)果與分子生物學(xué)中最常用的PCR法相比較,結(jié)果表明建立的NG/Au NPs電化學(xué)DNA傳感器檢測方法速度更快、靈敏度更高,在臨床上實現(xiàn)對白血病多藥耐藥相關(guān)基因MDR1的檢測方面具有良好的應(yīng)用潛力。(3)基于3D NG/Fe3O4構(gòu)建的新型DNA生物傳感器研究在上一章的研究基礎(chǔ)上,整合2D石墨烯制備具有三維(3D)泡沫結(jié)構(gòu)的功能化石墨烯。采用環(huán)保綠色,操作簡便的一步水熱法自組裝合成三維石墨烯-四氧化三鐵水凝膠(3D NG-Fe3O4)材料,對其三維結(jié)構(gòu)形成機(jī)理進(jìn)行探討。功能化的3D NG不僅保持了石墨烯固有的品質(zhì),而且在電催化反應(yīng)和導(dǎo)電材料等方面具有相對二維(2D)石墨烯材料更優(yōu)越的性能,比如高孔隙率、高活性比表面積、柔韌性以及更優(yōu)異的導(dǎo)電性等。各種技術(shù)(SEM、TEM、EDX和XPS)被用來表征3D NG-Fe3O4的結(jié)構(gòu)和組成,并在最優(yōu)化實驗條件下運用3D NG-Fe3O4修飾的生物傳感器與目標(biāo)DNA雜交反應(yīng)并靈敏度分析。采用標(biāo)準(zhǔn)加樣法研究了3D NG/Fe3O4修飾的生物傳感器在白血病人血清環(huán)境中分析檢測MDR1基因序列的能力,分別在TE buffer溶液,1%人血清,5%人血清中均具有良好的檢測識別能力,抗干擾性較好。(4)3D GF/Ag NPs電化學(xué)DNA傳感器的構(gòu)建并用于非小細(xì)胞肺癌CYFRA21-1基因RT-PCR酶切產(chǎn)物的檢測采用化學(xué)氣相沉積法(CVD),以CH4為碳源,泡沫鎳為三維模板和催化劑,制備結(jié)構(gòu)更加立體和均勻的3D石墨烯材料,利用SEM、TEM、EDX及接觸角檢測對材料的理化特性進(jìn)行表征。證明制備的3D GF是高品質(zhì)、幾乎無缺陷的。再利用電沉積法將銀納米顆粒(Ag NPs)復(fù)合到3D GF的三維立體碳骨架上,使完美的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)表面覆蓋一層具有優(yōu)異性能的Ag NPs并改善3D GF親水性。通過考察電位掃描速度與ss DNA/3D GF/Ag NPs/GCE的電化學(xué)響應(yīng)的關(guān)系,探討其修飾電極表面的動力學(xué)機(jī)理,證明了3D GF/Ag NPs穩(wěn)定立體的多孔貫通結(jié)構(gòu),不僅極大的增大電極的有效面積,也為ss DNA探針序列在電極表面的負(fù)載提供了有利條件,3D GF/Ag NPs是一個新穎的、有前途的電化學(xué)DNA傳感器修飾材料�；�3D GF/Ag NPs構(gòu)建的電化學(xué)DNA傳感器對非小細(xì)胞肺癌基因CYFRA21-1實際樣品的檢測效果滿意,證明該方法的準(zhǔn)確性。(5)DNA標(biāo)記的三明治型生物傳感器對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的檢測研究制備一種三明治型免疫傳感器用于電化學(xué)測定人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的檢測,并結(jié)合電化學(xué)生物傳感器和DNA修飾抗體的優(yōu)點。首先用3D GF作為理想的電極底層材料,再利用金納米籠功能化MWCNT材料作為乳腺癌ER蛋白抗體(antibody-ER,Ab1)的吸附基底。利用UV、SEM、TEM及細(xì)胞毒性測試對材料的理化特性進(jìn)行表征。Au NCs與MWCNT-NH2復(fù)合物具有低毒性、高活性比表面積、良好的生物兼容環(huán)境以及其新穎獨特籠狀結(jié)構(gòu),能夠有效增強(qiáng)了電極表面的電子轉(zhuǎn)移能力,且與Ab1抗體間發(fā)生高強(qiáng)度地形反應(yīng),增加了Ab1在電極表面的固載量,從而能夠?qū)⒏嗟娜橄侔㎝CF-7細(xì)胞吸附在傳感器上。利用偶聯(lián)劑EDC+NHS的作用將ss DNA的5’端修飾乳腺癌ER蛋白抗體制備ss DNA-Ab2生物探針分子,這種方式既避免了抗體酶標(biāo)記的過程,又具有較高的捕獲效率。最后通過構(gòu)建修飾有功能化納米材料-抗體Ab1、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和ss DNA-Ab2生物探針的三明治型仿生界面成功實現(xiàn)對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的測定。該免疫傳感器也具有較好重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,同也適用于其他相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。這種構(gòu)建方式為腫瘤細(xì)胞檢測提供了一種有效的電化學(xué)檢測手段,也為免疫傳感器的構(gòu)建打開了一種新思路。
[Abstract]:闅忕潃宸ヤ笟鍖栬繘紼嬫棩鐩婂姞蹇，

本文編號：1765791