本文選題：ARHI + 結(jié)腸癌��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景結(jié)腸癌是多見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)生的概率在國(guó)內(nèi)外均呈上升傾向,在男女性中發(fā)病和死亡的概率均居于各轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的第三位[1]。早期不易發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的臨床癥狀及體征,超過(guò)一半的病人在確診結(jié)腸癌時(shí)已經(jīng)伴隨肺臟或者其它器官的轉(zhuǎn)移,確診時(shí)常已發(fā)生轉(zhuǎn)移,而15%以上的病人伴隨著肝臟轉(zhuǎn)移[2],結(jié)腸癌病死率高,按5年統(tǒng)計(jì),早期生存率約92%,而晚期患者卻只有16%[3],所以使得結(jié)腸癌治療的難度加大,而且預(yù)后差。盡管目前國(guó)內(nèi)外研究在診斷和治療結(jié)腸癌方面有較大的研究和進(jìn)步,但目前在胃腸道研究方面早期診斷結(jié)腸癌的方法仍然很局限[4]。腫瘤的產(chǎn)生、生長(zhǎng)與多種調(diào)控基因的活性息息相關(guān)。而參與其中的調(diào)控基因與蛋白的表達(dá)失調(diào)和細(xì)胞克隆增殖、遷移、侵襲、周期及凋亡緊密相關(guān)。抑癌基因ARHI(Aplysia Ras Homolog I,DIRAS3,NOEY2)可以參與相關(guān)周期及凋亡調(diào)節(jié)通路,通過(guò)影響通路下游相關(guān)蛋白的表達(dá),而發(fā)揮生物學(xué)活性。其作用可以使正調(diào)控周期蛋白如cyclin D1表達(dá)明顯下降,從而影響周期發(fā)展而抑制其無(wú)限繁殖。同時(shí)可以影響經(jīng)典的凋亡相關(guān)蛋白,如Bcl-2和Bax等,增加凋亡率而達(dá)到抑癌作用。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒,將目的基因ARHI成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入結(jié)腸癌Ca Co2和SW480細(xì)胞株中。通過(guò)觀察轉(zhuǎn)染后及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,深入探討ARHI基因的生物學(xué)活性。檢測(cè)在轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá),研究ARHI起作用的方式和信號(hào)通路,期待為結(jié)腸癌基因?qū)用娴闹委熖峁┯杏玫陌悬c(diǎn),為早期診斷及治療提供理論憑據(jù)。目的通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),利用重組質(zhì)粒將ARHI轉(zhuǎn)染入選中的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,挑選出與對(duì)照組表達(dá)有明顯差異的結(jié)腸癌細(xì)胞株,構(gòu)建出高表達(dá)ARHI基因的穩(wěn)定株。研究ARHI基因?qū)Y(jié)腸癌Ca Co2和SW480細(xì)胞株凋亡、周期、增殖、克隆形成、侵襲及遷移等影響。經(jīng)過(guò)測(cè)試相關(guān)蛋白在通路中表達(dá),探索ARHI參與發(fā)揮功能的可能機(jī)制及可能參與的傳導(dǎo)通路。為深入研究ARHI在結(jié)腸癌的產(chǎn)生、生長(zhǎng)及臨床基因?qū)用娴闹委煿┙o相關(guān)的理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法1.委托上海吉?jiǎng)P基因生物有限公司構(gòu)建針對(duì)目標(biāo)基因ARHI構(gòu)建重組質(zhì)粒,分別為pc DNA3.1-flag和pc DNA3.1-flag ARHI重組質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)挑選四種不一樣的結(jié)腸癌細(xì)胞系,選出兩種滿意的為對(duì)象細(xì)胞系轉(zhuǎn)染,構(gòu)建出兩種ARHI基因高表達(dá)的細(xì)胞株。每種細(xì)胞株分為目標(biāo)基因pc DNA3.1-flag-ARHI轉(zhuǎn)染組(ARHI)、轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-flag空質(zhì)粒組(vector)。2.采取RT-PCR技術(shù)檢驗(yàn)ARHI基因在結(jié)腸惡性腫瘤細(xì)胞與其正常粘膜組織中的差異性表達(dá),從而篩選出低或不表達(dá)ARHI基因的結(jié)腸惡性腫瘤細(xì)胞。3.采用RT-PCR和Western blot技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后的ARHI m RNA。4.采用Western blot方法測(cè)試轉(zhuǎn)染后ARHI基因蛋白及通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。5.利用單克隆形成及CCK8實(shí)驗(yàn)檢查目的組和空質(zhì)粒對(duì)照組中細(xì)胞的增殖能力。6.利用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)試ARHI組和Vector組細(xì)胞的周期和凋亡。7.利用Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞在ARHI組及Vector組中的侵襲和遷移情況。8.利用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS19.0軟件對(duì)以上實(shí)驗(yàn)中所得的數(shù)據(jù)予統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1.ARHI基因在正常粘膜組織中高表達(dá),但在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)為表達(dá)較低甚至不表達(dá)。我們選擇Ca Co2和SW480兩株細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。2.將重組質(zhì)粒pc DNA3.1-flag和pc DNA3.1-flag-ARHI轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌Ca Co2和SW480細(xì)胞中,從而獲得高表達(dá)ARHI兩種細(xì)胞3.CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示:高表達(dá)ARHI能抑制細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)驗(yàn)兩組細(xì)胞的凋亡,結(jié)果提示:pc DNA3.1-flag-ARHI組中細(xì)胞凋亡較pc DNA3.1-flag組明顯增多;流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)驗(yàn)兩組細(xì)胞的周期,提示:pc DNA3.1-flag-ARHI轉(zhuǎn)染組中處于G0/G1期的細(xì)胞明顯多于對(duì)照組;Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:pc DNA3.1-flag-ARHI轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲及遷移能力均弱于pc DNA3.1-flag空載體組。4.重組質(zhì)粒ARHI組中p-AKT的表達(dá)較空質(zhì)粒組中表達(dá)降低,而p53和GSK-3β均在重組質(zhì)粒ARHI組中高表達(dá),ARHI目的組中cyclin D1的表達(dá)比空白對(duì)照組中低,且將細(xì)胞周期停滯在G1期。負(fù)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2低表達(dá),而凋亡正調(diào)控相關(guān)蛋白Bax表達(dá)相對(duì)升高。而AKT在兩個(gè)組中均無(wú)明顯表達(dá)差異。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ARHI的表達(dá)于結(jié)腸癌細(xì)胞株和其正常粘膜組織中存在明顯不一致,且于后者中高表達(dá),而于前者中表達(dá)較低或不表達(dá)。根據(jù)此結(jié)論猜測(cè),ARHI或許參與了結(jié)腸癌的產(chǎn)生和生長(zhǎng),并主要扮演攔阻角色。于是構(gòu)建了ARHI高表達(dá)的Ca Co2及SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)證實(shí)ARHI過(guò)表達(dá)可以阻止周期生長(zhǎng),并將其攔阻于G0/G1期,從而阻礙細(xì)胞的克隆及增殖能力;經(jīng)過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2以及Bax促進(jìn)結(jié)腸惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡;同時(shí)降低其侵襲及遷移能力。我們結(jié)果得出ARHI可能通過(guò)抑制PI3K/AKT通路,促進(jìn)下游GSK-3β的表達(dá),從而進(jìn)一步增強(qiáng)了GSK-3β于cyclin D1的阻礙,以此阻滯了細(xì)胞的周期發(fā)展;另一方面,ARHI可能經(jīng)過(guò)阻礙PI3K/AKT傳導(dǎo)通路,阻礙AKT磷酸化,能高表達(dá)下游p53,使Bcl-2表達(dá)下降,而Bax則升高,以增加細(xì)胞的凋亡率,施展生物學(xué)效應(yīng)。但對(duì)于ARHI具體發(fā)揮作用位點(diǎn)還需要在進(jìn)一步的研究中探索。
[Abstract]:Background colon cancer is one of the most common malignant tumors . The probability of occurrence is increasing both at home and abroad . It is difficult to find the clinical symptoms and signs of colon cancer in the early stage . More than half of patients have been transferred from lung or other organs in the diagnosis of colon cancer . 鑲跨槫鐨勪駭鐢，

本文編號(hào)：1763799