發(fā)布時(shí)間：2018-04-16 19:28

  本文選題：作用于雙鏈RNA的腺苷脫氨酶1 + 解螺旋酶17��； 參考：《成都醫(yī)學(xué)院》2016年碩士論文

【摘要】：腺苷脫氨酶ADAR1(Adenosine to inosine acting on RNA enzyme 1)是作用于雙鏈RNA上,催化腺嘌呤轉(zhuǎn)換為次黃嘌呤的A-to-I RNA編輯酶家族成員之一,其與雙鏈RNA結(jié)合蛋白發(fā)生相互作用參與相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。ADAR1相互作用蛋白主要分為兩類:一類是依賴RNA編輯功能發(fā)生相互作用的蛋白,如PKR與ADAR1相互作用影響病毒的復(fù)制;另一類是不依賴RNA編輯功能發(fā)生相互作用的蛋白,如NF45、NF90、h Upf1及Dicer酶等,其中Dicer酶與ADAR1相互作用促進(jìn)mi RNA合成。由此可見,ADAR1與相互作用蛋白形成的復(fù)合物參與機(jī)體內(nèi)重要生物學(xué)過程。肝癌是我國(guó)高發(fā)的腫瘤之一,let-7家族是在肝癌中表達(dá)較高的mi RNA,可能成為肝癌標(biāo)記物。研究報(bào)道,通過高通量測(cè)序結(jié)果顯示ADAR1對(duì)let-7家族部分成員具有編輯作用,另一部分研究表明ADAR1不依賴RNA編輯與Dicer相互作用促進(jìn)let-7合成。而在肝癌中研究ADAR1相互作用蛋白對(duì)let-7合成的影響尚未見報(bào)道。在此基礎(chǔ)上,本研究將采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選及驗(yàn)證ADAR1相互作用蛋白;在肝癌中初步探討ADAR1及其相互作用蛋白對(duì)mature let-7合成及肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。目的篩選及驗(yàn)證肝癌中ADAR1相互作用蛋白;初步探討ADAR1及相互作用蛋白與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性;初步研究ADAR1與相互作用蛋白在肝癌中對(duì)miRNA的合成及肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。方法1.構(gòu)建載體:采用GV-166構(gòu)建ADAR1過表達(dá)載體,PCR及測(cè)序鑒定該載體正確性。2.包裝ADAR1過表達(dá)慢病毒:將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒包裝至慢病毒顆粒,瞬時(shí)感染293T細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒滴度及ADAR1 m RNA表達(dá)水平。3.建立ADAR1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系:在人正常胚胎肝臟L02細(xì)胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ADAR1過表達(dá)慢病毒,采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)ADAR1細(xì)胞,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)ADAR1 mRNA及蛋白表達(dá)水平,獲得ADAR1穩(wěn)定過表達(dá)L02細(xì)胞系。4.篩選及驗(yàn)證ADAR1相互作用蛋白:本研究結(jié)合免疫共沉(Co-Immunopreci--pitation,Co-IP)、Western blot、質(zhì)譜非標(biāo)記法(Label free)等蛋白質(zhì)組學(xué)方法,采用非標(biāo)法對(duì)蛋白進(jìn)行定性分析,檢測(cè)ADAR1相互作用蛋白,采用生物信息學(xué)分析篩選ADAR1相互作用蛋白。采用細(xì)胞免疫熒光的方法,鑒定ADAR1與相互作用蛋白在肝癌細(xì)胞中的定位及表達(dá)情況。5.檢測(cè)肝癌細(xì)胞中ADAR1及相互作用蛋白表達(dá)情況:采用Western blot在9種肝癌細(xì)胞株中檢測(cè)ADAR1與相互作用蛋白二者蛋白表達(dá)情況。6.鑒定肝癌組織中ADAR1及相互作用蛋白表達(dá)及定位:本研究采用免疫組化的方法檢測(cè)8例肝癌患者的癌及癌旁組織標(biāo)本中ADAR1與相互作用蛋白的表達(dá)情況,分析二者與肝癌發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系。7.篩選ADAR1相關(guān)差異表達(dá)mi RNAs:本研究采用Nano String技術(shù)對(duì)ADAR1穩(wěn)定過表達(dá)L02細(xì)胞系進(jìn)行mi RNA差異分析。8.下調(diào)ADAR1及相互作用蛋白,研究ADAR1及相互作用蛋白在肝癌中對(duì)mi RNA processing的影響:應(yīng)用si RNA干擾技術(shù),設(shè)計(jì)ADAR1及相互作用蛋白的si RNA干擾序列,瞬時(shí)感染人肝癌細(xì)胞MHCC97-H、人正常胚胎肝臟細(xì)胞L02和ADAR1穩(wěn)定過表達(dá)L02細(xì)胞系,再采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ADAR1及相互作用蛋白形成的復(fù)合物對(duì)mi RNA processing的影響。9.下調(diào)ADAR1及相互作用蛋白,采用transwell assay初步探討二者對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響:首先采用si RNA技術(shù)敲降A(chǔ)DAR1及相互作用蛋白,Western blot檢測(cè)ADAR1及相互作用蛋白的表達(dá);再采用transwell assay初步研究下調(diào)ADAR1及相互作用蛋白后對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果1.在L02細(xì)胞中成功構(gòu)建ADAR1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系:通過GV-166載體線性化,引物設(shè)計(jì)合成,PCR擴(kuò)增,酶切等過程,測(cè)序及PCR鑒定載體正確;質(zhì)粒載體抽提,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,得到高滴度的慢病毒濃縮液,在293T細(xì)胞中測(cè)定病毒滴度為2E+8 TU/ml;在L02細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ADAR1過表達(dá)慢病毒載體,經(jīng)嘌呤霉素藥物篩選,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞中ADAR1的m RNA及蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示在ADAR1穩(wěn)定過表達(dá)L02細(xì)胞中ADAR1表達(dá)均比對(duì)照細(xì)胞高3倍左右,最終獲得L02-ADAR1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。2.篩選及鑒定ADAR1相互作用蛋白:采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,獲得ADAR1相互作用蛋白,并結(jié)合生物信息學(xué)分析,找到目標(biāo)蛋白—RNA解螺旋酶DDX17,再使用Co-IP的方法驗(yàn)證ADAR1與DDX17直接相互作用。利用免疫共定位的方法,發(fā)現(xiàn)ADAR1與DDX17在細(xì)胞核內(nèi)存在共定位。3.ADAR1與DDX17在肝癌中的表達(dá):首先采用Western Blot方法對(duì)9株肝癌細(xì)胞進(jìn)行ADAR1與DDX17蛋白表達(dá)的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中均存在二者的表達(dá),并選定人肝癌細(xì)胞MHCC97-H為內(nèi)源性IP的細(xì)胞模型;采用免疫組化的方法,在連續(xù)切片中,確認(rèn)二者均有表達(dá),由于樣本量較小,后期我們將擴(kuò)大肝癌樣本量,再進(jìn)行臨床病理特征分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)。4.篩選ADAR1相關(guān)差異表達(dá)mi RNAs:采用Nano String技術(shù),發(fā)現(xiàn)mi RNA共有236個(gè)。篩選獲得上調(diào)的mi RNAs有37個(gè),下調(diào)的mi RNAs有45個(gè)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及課題研究,我們?cè)谙抡{(diào)的45個(gè)mi RNAs中挑選出4個(gè)目的mi RNAs,即:let-7c-5p,let-7e-5p,mi R-222-3p以及mi R-27a-3p。5.采用si RNA干擾技術(shù),敲降A(chǔ)DAR1/DDX17后,觀察二者對(duì)mi RNA processing的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,二者對(duì)成熟的mi RNA無明顯影響,而對(duì)pri-mi RNA及pre-mi RNA的影響我們正在進(jìn)行深入探討。6.采用transwell assay,初步研究結(jié)果顯示下調(diào)ADAR1/DDX17抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力。結(jié)論1.成功構(gòu)建ADAR1過表達(dá)慢病毒載體。2.建立ADAR1穩(wěn)定表達(dá)L02細(xì)胞系。3.篩選及鑒定ADAR1相互作用蛋白,即DDX17。4.ADAR1/DDX17在細(xì)胞核內(nèi)存在共定位。5.通過內(nèi)、外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證DDX17為ADAR1相互作用蛋白。6.ADAR1/DDX17在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中存在表達(dá)。7.本研究發(fā)現(xiàn)ADAR1/DDX17在肝癌中對(duì)成熟的mi RNAs合成無明顯影響。8.通過transwell assay初步研究發(fā)現(xiàn)ADAR1/DDX17促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移能力。
[Abstract]:鑵鴻嫹鑴辨皚閰禔DAR1(Adenosine to inosine acting on RNA enzyme 1)鏄綔鐢ㄤ簬鍙岄摼RNA涓，

本文編號(hào)：1760273