本文選題：前列腺癌 + PCAT14��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：引言血清PSA篩查的普及極大的提高了前列腺癌的檢出率,同時(shí)也造成了前列腺癌的過(guò)度診療。新型前列腺癌診斷標(biāo)志物如長(zhǎng)鏈非編碼RNA PCA3和融合基因TMPRSS2-ERG,雖然能夠提高前列腺癌診斷的特異性,卻無(wú)預(yù)后價(jià)值。目前臨床上綜合各項(xiàng)臨床病理特征進(jìn)行病人的風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)和制定診療策略。然而這種風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)方式尚不夠精確,遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足個(gè)體化診療的需求。因此,研究能夠鑒別惰性和進(jìn)展性前列腺癌的預(yù)后分子標(biāo)志物仍舊是在前列腺癌臨床基礎(chǔ)研究方面的一大挑戰(zhàn)。得益于新一代測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展,人們對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)錄本有了更加全面的認(rèn)識(shí),特別是占人類(lèi)基因組80%以上的非編碼RNA。其中一類(lèi)長(zhǎng)度大于200nt的非編碼RNA稱(chēng)為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。lncRNA且備特殊的組織特異性和腫瘤特異性的表達(dá)譜,越來(lái)越多的研究支持lncRNA作為一類(lèi)潛在的分子標(biāo)志物。本研究中我們利用已發(fā)表的RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù),包括TCGA, SU2C等,系統(tǒng)全面的分析了與惰性前列腺癌和惡性進(jìn)展性前列腺癌相關(guān)的基因(包括編碼基因和非編碼基因),并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的lncRNA PCAT14。PCAT14在前列腺癌組織中有較高的表達(dá)水平,具備前列腺組織和腫瘤特異性的表達(dá)譜,且與前列腺癌的低Gleason分級(jí)相關(guān)。我們進(jìn)一步闡明了PCAT14的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控,并應(yīng)用大樣本量前列腺癌隊(duì)列評(píng)價(jià)了PCAT14作為分子標(biāo)志物在前列腺癌中的診斷和預(yù)后價(jià)值；其次我們開(kāi)發(fā)出一種新的RNA-ISH技術(shù)可在臨床前列腺癌FFPE標(biāo)本中檢測(cè)PCAT14的表達(dá),極大的擴(kuò)展了PCAT14的臨床應(yīng)用前景；最后,我們應(yīng)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探究了其在前列腺癌中的生物學(xué)作用。研究目的1.系統(tǒng)尋找前列腺癌中潛在的分子標(biāo)志物。2.研究PCAT14作為分子標(biāo)志物在前列腺癌中的診斷和預(yù)后價(jià)值。3.探究PCAT14在前列腺癌中的生物學(xué)作用機(jī)制。研究方法1.提取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌RNA-Seq數(shù)據(jù)分析低Gleason分級(jí)(GS=6)與高Gleason分級(jí)(GS=9+)之間差異性表達(dá)的基因。2.運(yùn)用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)、PCR技術(shù)和Sanger測(cè)序驗(yàn)證候選基因PCAT14在前列腺癌中的表達(dá)及PCAT14的基因結(jié)構(gòu)。3.提取兩個(gè)獨(dú)立的前列腺癌外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)John Hopkins cohort和Taylor's cohort,應(yīng)用one-way ANOVA分析PCAT14在不同前列腺癌Gleason評(píng)分亞組間的差異性表達(dá),應(yīng)用工作者受試曲線(ROC)評(píng)價(jià)PCAT14診斷前列腺癌的靈敏度和特異性,用Kaplan-Meier生存曲線和多因素cox回歸模型分析PCAT14診斷前列腺癌生化復(fù)發(fā)、腫瘤特異性進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和總生存率的價(jià)值。4.應(yīng)用CRISPR-dcas9/SAM系統(tǒng)或RNAi技術(shù),以細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PCAT14在前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用。研究結(jié)果1.PCAT14是與前列腺癌低Gleason評(píng)分(GS=6)相關(guān)的基因。2. PCAT14是前列腺癌腫瘤和組織特異性lncRNA。3. PCAT14位于22號(hào)染色體基因荒漠區(qū),有3個(gè)異構(gòu)體,其主要異構(gòu)體有4個(gè)外顯子。4. PCAT14是一個(gè)雄激素受體(AR)調(diào)控的基因。5.PCAT14啟動(dòng)子區(qū)域甲基化參與了其表達(dá)調(diào)控。6.受試者工作曲線(ROC)分析示PCAT14表達(dá)水平可鑒別出良性前列腺組織和前列腺癌組織,在TCGA前列腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)和Taylor cohort的曲線下面積(AUC)分別為0.837和0.823。7.在John Hopkin's cohort中,多因素cox回歸模型生存分析示PCAT14可作為獨(dú)立預(yù)后因子指示好的無(wú)生化進(jìn)展生存率(BPFS,P=0.00126,HR=0.64),無(wú)轉(zhuǎn)移生存率(MFS, P=0.000609; HR=0.52)和無(wú)進(jìn)展生存率(PSS, P=0.0385; HR= 0.55)。8.在臨床前列腺癌FFPE組織芯片中應(yīng)用RNA-ISH染色示PCAT14在前列腺癌組織中高表達(dá),在胞核和胞漿中分布基本相等,但在正常前列腺組織中不表達(dá)。9.以CRISPR-dcas9/SAM系統(tǒng)在前列腺癌細(xì)胞PC3和LNCaP中過(guò)表達(dá)PCAT14后進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),結(jié)果示PCAT14過(guò)表達(dá)顯著抑制PC3和LNCaP細(xì)胞的侵襲能力(所有P0.05)。研究結(jié)論1. PCAT14具備前列腺癌腫瘤特異性和組織特異性的表達(dá)譜,PCAT14的高表達(dá)與低Gleason分級(jí)顯著相關(guān)。2. PCAT14表達(dá)受AR和啟動(dòng)子區(qū)域甲基化調(diào)控。3. PCAT14可作為前列腺癌的診斷標(biāo)志物和預(yù)后標(biāo)志物,可以聯(lián)合各項(xiàng)臨床病理參數(shù)更好的進(jìn)行疾病的診斷和預(yù)后判斷。4.我們開(kāi)發(fā)了一種新型RNA-ISH技術(shù)可在前列腺癌FFPE組織檢測(cè)PCAT14的表達(dá),以鑒別良惡性前列腺組織。5. PCAT14的過(guò)表達(dá)可顯著降低前列腺癌細(xì)胞的侵襲作用。腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)是成人泌尿系腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤,同時(shí)也是預(yù)后最差的泌尿系腫瘤。一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,ccRCC患者五年生存率僅不足9%。因此,尋找可用于腎癌早期診斷和判斷預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物是一項(xiàng)重要的臨床和基礎(chǔ)研究目標(biāo)。Pontin與reptin是多種細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的ATP酶(ATPase associated with diverse cellular activities)超家族中的一員,且在進(jìn)化中序列高度保守。研究表明Pontin和reptin廣泛參與了與腫瘤發(fā)生相關(guān)的染色質(zhì)重構(gòu),轉(zhuǎn)錄調(diào)控,DNA損傷修復(fù)和snoRNA的生物合成等。我們的前期研究表明reptin在腎癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用,然而其同源異構(gòu)體Pontin在腎癌中的表達(dá)及生物學(xué)作用尚不清楚。近期研究表明自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)在抗腫瘤的固有免疫中發(fā)揮了重要的作用。NKG2D是NK細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞上的一個(gè)激活受體,其配體MICA與NKG2D的結(jié)合將促進(jìn)NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤的細(xì)胞毒作用。MICA廣泛表達(dá)于多種上皮來(lái)源性腫瘤,胞膜上MICA的表達(dá)將腫瘤細(xì)胞靶向NK細(xì)胞,并最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。多個(gè)研究表明MICA在結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中可作為預(yù)后因子。然而MICA在腎癌中的生物學(xué)作用及臨床預(yù)后價(jià)值目前尚不清楚。本研究應(yīng)用大樣本量ccRCC組織標(biāo)本探究Pontin和MICA在ccRCC中的表達(dá)及其臨床預(yù)后價(jià)值,并以細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)初步探討了Pontin在ccRCC發(fā)生進(jìn)展中的生物學(xué)作用和潛在的機(jī)制。研究目的1.評(píng)價(jià)Pontin在ccRCC中的表達(dá)和其臨床預(yù)后價(jià)值,并探究其在腎癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用及其潛在機(jī)制。2.評(píng)價(jià)MICA在ccRCC中的表達(dá)和其臨床預(yù)后價(jià)值。研究方法1.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、western blotting和免疫組化(IHC)技術(shù)在ccRCC臨床標(biāo)本中檢測(cè)Pontin的表達(dá)。2.應(yīng)用siRNA在腎癌細(xì)胞株A498,786-0和KRC/Y中降表達(dá)Pontin,以細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)估Pontin降表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。3.應(yīng)用熒光免疫細(xì)胞組化技術(shù)檢測(cè)Pontin對(duì)β-catenin亞細(xì)胞分布的影響,用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Pontin對(duì)β-catenin下游靶基因c-myc和cyclinD1的影響。4.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和IHC技術(shù)在ccRCC臨床標(biāo)本中檢測(cè)MICA的表達(dá)。5.提取TCGA RCC RNA-Seq數(shù)據(jù)驗(yàn)證MICA在腎癌中的差異性表達(dá)。6.應(yīng)用基因簇富集分析(GSEA)檢測(cè)MICA高表達(dá)促進(jìn)腎癌惡性進(jìn)展的機(jī)制。研究結(jié)果1.相比于正常腎組織,Pontin mRNA和蛋白表達(dá)水平在ccRCC中顯著上調(diào)(P=0.0016;P=0.0095)。E-cadherin蛋白的表達(dá)水平相較于正常腎組織顯著下調(diào)(P0.001)。2.IHC示Pontin在91.6%ccRCC組織中表達(dá)陽(yáng)性,在胞核及胞漿中均有分布；熒光免疫細(xì)胞組化示Pontin在腎癌細(xì)胞株A498和786-0中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),主要分布在胞漿中。Pontin在正常腎組織或細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。3.腎癌患者中強(qiáng)陽(yáng)性的Pontin胞漿染色顯著與臨床分期(P=0.003)、細(xì)胞核組織學(xué)分級(jí)(P=0.025)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.010)相關(guān)。4. Kaplan-Meier生存曲線與單因素cox回歸模型生存分析結(jié)果一致,強(qiáng)陽(yáng)性的Pontin胞漿染色顯著與不良的預(yù)后相關(guān)。多因素cox回歸模型分析示強(qiáng)陽(yáng)性的Pontin胞漿染色可獨(dú)立判斷ccRCC患者的預(yù)后(HR：1.124-6.337,P=0.026)。5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)示兩條siRNA介導(dǎo)的Pontin降表達(dá)顯著降低了腎癌細(xì)胞A498、786-0和KRC/Y的遷移能力(P0.0001)和侵襲能力(P0.001)。6.熒光細(xì)胞免疫組化結(jié)果示Pontin表達(dá)降低導(dǎo)致了胞核中β-catenin表達(dá)顯著下調(diào)；實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果示β-catenin的經(jīng)典靶基因c-myc和cyclin D1表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。7.在20對(duì)冰凍ccRCC臨床標(biāo)本中實(shí)時(shí)定量RT-PCR不MICA在ccRCC中的表達(dá)量顯著高于正常腎組織(P0.0001)。8.IHC示MICA在95.8%ccRCC組織中表達(dá)陽(yáng)性。MICA在表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性的組織中分布于細(xì)胞膜和呈顆粒狀分布于細(xì)胞漿,然而在弱表達(dá)的組織中主要分布于細(xì)胞膜。相反,在正常腎組織中,MICA幾乎探測(cè)不到。9. MICA表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.001)和臨床分期(P=0.003)顯著相關(guān),10.多因素cox回歸模型分析示MICA表達(dá)水平可獨(dú)立判斷ccRCC患者腫瘤特異性生存率(HR：1.023-9.216,P=0.045)。11. GSEA結(jié)果示在EMT基因簇在TCGA ccRCC MICA高表達(dá)組中富集(enrichment score=1.7395, nominal P value=0.0166);實(shí)時(shí)定量RT-PCR示EMT間皮標(biāo)志物Snail在MICA高表達(dá)組的表達(dá)水平顯著高于MICA低表達(dá)組的表達(dá)水平(P=0.0476)。研究結(jié)論1. Pontin在ccRCC中的表達(dá)量顯著高于正常腎組織,其在腎癌細(xì)胞胞核和胞漿中均有表達(dá)；胞漿Pontin表達(dá)與進(jìn)展性腎癌相關(guān)。2.胞漿Pontin表達(dá)可作為ccRCC的預(yù)后標(biāo)志物。3. Pontin高表達(dá)激活EMT通路,下調(diào)E-cadherin進(jìn)而增加β-catenin的胞核定位是Pontin促進(jìn)腎癌細(xì)胞侵襲遷移的潛在機(jī)制；Pontin有潛質(zhì)作為腎癌治療的新靶點(diǎn)。4. MICA在ccRCC中的表達(dá)量顯著高于正常腎組織；其表達(dá)方式隨表達(dá)水平升高而不同,在表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性的組織中分布于細(xì)胞膜或呈顆粒狀分布于細(xì)胞漿,而在弱表達(dá)的組織中則主要分布于細(xì)胞膜。胞漿表達(dá)的MICA可能參與了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。5. MICA表達(dá)水平與進(jìn)展性腎癌相關(guān),可作為ccRCC的預(yù)后標(biāo)志物。6. MICA在腎癌中的作用可能與EMT通路激活有關(guān),需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25;R737.11
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本文編號(hào)：1756037