本文選題：前列腺癌 + PCAT14�。� 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：引言血清PSA篩查的普及極大的提高了前列腺癌的檢出率,同時也造成了前列腺癌的過度診療。新型前列腺癌診斷標志物如長鏈非編碼RNA PCA3和融合基因TMPRSS2-ERG,雖然能夠提高前列腺癌診斷的特異性,卻無預后價值。目前臨床上綜合各項臨床病理特征進行病人的風險分級和制定診療策略。然而這種風險分級方式尚不夠精確,遠不能滿足個體化診療的需求。因此,研究能夠鑒別惰性和進展性前列腺癌的預后分子標志物仍舊是在前列腺癌臨床基礎研究方面的一大挑戰(zhàn)。得益于新一代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展,人們對腫瘤轉(zhuǎn)錄本有了更加全面的認識,特別是占人類基因組80%以上的非編碼RNA。其中一類長度大于200nt的非編碼RNA稱為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。lncRNA且備特殊的組織特異性和腫瘤特異性的表達譜,越來越多的研究支持lncRNA作為一類潛在的分子標志物。本研究中我們利用已發(fā)表的RNA-Seq數(shù)據(jù)庫,包括TCGA, SU2C等,系統(tǒng)全面的分析了與惰性前列腺癌和惡性進展性前列腺癌相關的基因(包括編碼基因和非編碼基因),并發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA PCAT14。PCAT14在前列腺癌組織中有較高的表達水平,具備前列腺組織和腫瘤特異性的表達譜,且與前列腺癌的低Gleason分級相關。我們進一步闡明了PCAT14的基因結(jié)構(gòu)及表達調(diào)控,并應用大樣本量前列腺癌隊列評價了PCAT14作為分子標志物在前列腺癌中的診斷和預后價值；其次我們開發(fā)出一種新的RNA-ISH技術(shù)可在臨床前列腺癌FFPE標本中檢測PCAT14的表達,極大的擴展了PCAT14的臨床應用前景；最后,我們應用細胞實驗初步探究了其在前列腺癌中的生物學作用。研究目的1.系統(tǒng)尋找前列腺癌中潛在的分子標志物。2.研究PCAT14作為分子標志物在前列腺癌中的診斷和預后價值。3.探究PCAT14在前列腺癌中的生物學作用機制。研究方法1.提取TCGA數(shù)據(jù)庫中前列腺癌RNA-Seq數(shù)據(jù)分析低Gleason分級(GS=6)與高Gleason分級(GS=9+)之間差異性表達的基因。2.運用cDNA末端快速擴增技術(shù)、PCR技術(shù)和Sanger測序驗證候選基因PCAT14在前列腺癌中的表達及PCAT14的基因結(jié)構(gòu)。3.提取兩個獨立的前列腺癌外顯子測序數(shù)據(jù)庫John Hopkins cohort和Taylor's cohort,應用one-way ANOVA分析PCAT14在不同前列腺癌Gleason評分亞組間的差異性表達,應用工作者受試曲線(ROC)評價PCAT14診斷前列腺癌的靈敏度和特異性,用Kaplan-Meier生存曲線和多因素cox回歸模型分析PCAT14診斷前列腺癌生化復發(fā)、腫瘤特異性進展、遠處轉(zhuǎn)移和總生存率的價值。4.應用CRISPR-dcas9/SAM系統(tǒng)或RNAi技術(shù),以細胞增殖實驗和細胞侵襲實驗檢測PCAT14在前列腺癌細胞中的生物學作用。研究結(jié)果1.PCAT14是與前列腺癌低Gleason評分(GS=6)相關的基因。2. PCAT14是前列腺癌腫瘤和組織特異性lncRNA。3. PCAT14位于22號染色體基因荒漠區(qū),有3個異構(gòu)體,其主要異構(gòu)體有4個外顯子。4. PCAT14是一個雄激素受體(AR)調(diào)控的基因。5.PCAT14啟動子區(qū)域甲基化參與了其表達調(diào)控。6.受試者工作曲線(ROC)分析示PCAT14表達水平可鑒別出良性前列腺組織和前列腺癌組織,在TCGA前列腺癌數(shù)據(jù)庫和Taylor cohort的曲線下面積(AUC)分別為0.837和0.823。7.在John Hopkin's cohort中,多因素cox回歸模型生存分析示PCAT14可作為獨立預后因子指示好的無生化進展生存率(BPFS,P=0.00126,HR=0.64),無轉(zhuǎn)移生存率(MFS, P=0.000609; HR=0.52)和無進展生存率(PSS, P=0.0385; HR= 0.55)。8.在臨床前列腺癌FFPE組織芯片中應用RNA-ISH染色示PCAT14在前列腺癌組織中高表達,在胞核和胞漿中分布基本相等,但在正常前列腺組織中不表達。9.以CRISPR-dcas9/SAM系統(tǒng)在前列腺癌細胞PC3和LNCaP中過表達PCAT14后進行細胞侵襲實驗,結(jié)果示PCAT14過表達顯著抑制PC3和LNCaP細胞的侵襲能力(所有P0.05)。研究結(jié)論1. PCAT14具備前列腺癌腫瘤特異性和組織特異性的表達譜,PCAT14的高表達與低Gleason分級顯著相關。2. PCAT14表達受AR和啟動子區(qū)域甲基化調(diào)控。3. PCAT14可作為前列腺癌的診斷標志物和預后標志物,可以聯(lián)合各項臨床病理參數(shù)更好的進行疾病的診斷和預后判斷。4.我們開發(fā)了一種新型RNA-ISH技術(shù)可在前列腺癌FFPE組織檢測PCAT14的表達,以鑒別良惡性前列腺組織。5. PCAT14的過表達可顯著降低前列腺癌細胞的侵襲作用。腎透明細胞癌(ccRCC)是成人泌尿系腫瘤中最常見的惡性腫瘤,同時也是預后最差的泌尿系腫瘤。一旦發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,ccRCC患者五年生存率僅不足9%。因此,尋找可用于腎癌早期診斷和判斷預后的生物學標志物是一項重要的臨床和基礎研究目標。Pontin與reptin是多種細胞活動相關的ATP酶(ATPase associated with diverse cellular activities)超家族中的一員,且在進化中序列高度保守。研究表明Pontin和reptin廣泛參與了與腫瘤發(fā)生相關的染色質(zhì)重構(gòu),轉(zhuǎn)錄調(diào)控,DNA損傷修復和snoRNA的生物合成等。我們的前期研究表明reptin在腎癌的惡性進展中發(fā)揮了重要作用,然而其同源異構(gòu)體Pontin在腎癌中的表達及生物學作用尚不清楚。近期研究表明自然殺傷細胞(NK細胞)在抗腫瘤的固有免疫中發(fā)揮了重要的作用。NKG2D是NK細胞和CD8+細胞毒性T淋巴細胞上的一個激活受體,其配體MICA與NKG2D的結(jié)合將促進NK細胞和T淋巴細胞發(fā)揮抗腫瘤的細胞毒作用。MICA廣泛表達于多種上皮來源性腫瘤,胞膜上MICA的表達將腫瘤細胞靶向NK細胞,并最終導致腫瘤細胞的死亡。多個研究表明MICA在結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和鱗狀細胞癌中可作為預后因子。然而MICA在腎癌中的生物學作用及臨床預后價值目前尚不清楚。本研究應用大樣本量ccRCC組織標本探究Pontin和MICA在ccRCC中的表達及其臨床預后價值,并以細胞學實驗初步探討了Pontin在ccRCC發(fā)生進展中的生物學作用和潛在的機制。研究目的1.評價Pontin在ccRCC中的表達和其臨床預后價值,并探究其在腎癌細胞中的生物學作用及其潛在機制。2.評價MICA在ccRCC中的表達和其臨床預后價值。研究方法1.應用實時定量RT-PCR、western blotting和免疫組化(IHC)技術(shù)在ccRCC臨床標本中檢測Pontin的表達。2.應用siRNA在腎癌細胞株A498,786-0和KRC/Y中降表達Pontin,以細胞劃痕實驗和transwell侵襲實驗評估Pontin降表達對腎癌細胞遷移侵襲能力的影響。3.應用熒光免疫細胞組化技術(shù)檢測Pontin對β-catenin亞細胞分布的影響,用實時定量RT-PCR檢測Pontin對β-catenin下游靶基因c-myc和cyclinD1的影響。4.應用實時定量RT-PCR和IHC技術(shù)在ccRCC臨床標本中檢測MICA的表達。5.提取TCGA RCC RNA-Seq數(shù)據(jù)驗證MICA在腎癌中的差異性表達。6.應用基因簇富集分析(GSEA)檢測MICA高表達促進腎癌惡性進展的機制。研究結(jié)果1.相比于正常腎組織,Pontin mRNA和蛋白表達水平在ccRCC中顯著上調(diào)(P=0.0016;P=0.0095)。E-cadherin蛋白的表達水平相較于正常腎組織顯著下調(diào)(P0.001)。2.IHC示Pontin在91.6%ccRCC組織中表達陽性,在胞核及胞漿中均有分布；熒光免疫細胞組化示Pontin在腎癌細胞株A498和786-0中呈強陽性表達,主要分布在胞漿中。Pontin在正常腎組織或細胞中幾乎不表達。3.腎癌患者中強陽性的Pontin胞漿染色顯著與臨床分期(P=0.003)、細胞核組織學分級(P=0.025)和遠處轉(zhuǎn)移(P=0.010)相關。4. Kaplan-Meier生存曲線與單因素cox回歸模型生存分析結(jié)果一致,強陽性的Pontin胞漿染色顯著與不良的預后相關。多因素cox回歸模型分析示強陽性的Pontin胞漿染色可獨立判斷ccRCC患者的預后(HR：1.124-6.337,P=0.026)。5.細胞劃痕實驗與細胞侵襲實驗示兩條siRNA介導的Pontin降表達顯著降低了腎癌細胞A498、786-0和KRC/Y的遷移能力(P0.0001)和侵襲能力(P0.001)。6.熒光細胞免疫組化結(jié)果示Pontin表達降低導致了胞核中β-catenin表達顯著下調(diào)；實時定量RT-PCR結(jié)果示β-catenin的經(jīng)典靶基因c-myc和cyclin D1表達顯著下調(diào)(P0.05)。7.在20對冰凍ccRCC臨床標本中實時定量RT-PCR不MICA在ccRCC中的表達量顯著高于正常腎組織(P0.0001)。8.IHC示MICA在95.8%ccRCC組織中表達陽性。MICA在表達強陽性的組織中分布于細胞膜和呈顆粒狀分布于細胞漿,然而在弱表達的組織中主要分布于細胞膜。相反,在正常腎組織中,MICA幾乎探測不到。9. MICA表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.001)和臨床分期(P=0.003)顯著相關,10.多因素cox回歸模型分析示MICA表達水平可獨立判斷ccRCC患者腫瘤特異性生存率(HR：1.023-9.216,P=0.045)。11. GSEA結(jié)果示在EMT基因簇在TCGA ccRCC MICA高表達組中富集(enrichment score=1.7395, nominal P value=0.0166);實時定量RT-PCR示EMT間皮標志物Snail在MICA高表達組的表達水平顯著高于MICA低表達組的表達水平(P=0.0476)。研究結(jié)論1. Pontin在ccRCC中的表達量顯著高于正常腎組織,其在腎癌細胞胞核和胞漿中均有表達；胞漿Pontin表達與進展性腎癌相關。2.胞漿Pontin表達可作為ccRCC的預后標志物。3. Pontin高表達激活EMT通路,下調(diào)E-cadherin進而增加β-catenin的胞核定位是Pontin促進腎癌細胞侵襲遷移的潛在機制；Pontin有潛質(zhì)作為腎癌治療的新靶點。4. MICA在ccRCC中的表達量顯著高于正常腎組織；其表達方式隨表達水平升高而不同,在表達強陽性的組織中分布于細胞膜或呈顆粒狀分布于細胞漿,而在弱表達的組織中則主要分布于細胞膜。胞漿表達的MICA可能參與了腫瘤細胞的免疫逃逸機制。5. MICA表達水平與進展性腎癌相關,可作為ccRCC的預后標志物。6. MICA在腎癌中的作用可能與EMT通路激活有關,需要進一步實驗研究。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25;R737.11
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本文編號：1756037