本文選題：LncRNAAK036396 + Fcnb��； 參考：《江蘇大學》2017年博士論文

【摘要】：目的:惡性腫瘤目前已經(jīng)成為人類死亡的主要疾病,盡管針對腫瘤的靶向治療發(fā)展迅速,但是總體治療效果仍然不夠理想。大量臨床研究表明,腫瘤的免疫逃逸是造成腫瘤治療失敗的主要因素。本研究中,我們通過探索長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA,LncRNA ) AK036396對粒細胞樣髓源性抑制細胞(Granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs)發(fā)育及功能的調(diào)控,尋找腫瘤免疫治療的新靶點。方法:1.采用Arraystar LncRNA表達譜芯片技術檢測在野生型小鼠脾臟來源CDllb+Ly6G+細胞與荷瘤小鼠腫瘤來源G-MDSCs中表達的lncRNA,篩選出表達呈現(xiàn)明顯差異的lncRNA,并利用實時熒光定量定量PCR(realtimefluorescene quantitative PCR, qRT-PCR)進行進一步的確認;利用 qRT-PCR 分析 lncRNA AK036396在不同髓系細胞以及不同發(fā)育階段G-MDSCs中的表達。2.分析Arraystar LncRNA表達譜芯片,篩選出lncRNA可能調(diào)控的靶分子,并使用qRT-PCR進行進一步驗證。利用qRT-PCR與Western-blot檢測在不同髓系細胞中靶分子Fcnb的表達情況。利用特異性siRNA抑制G-MDSCs中l(wèi)ncRNA AK036396的表達后,利用qRT-PCR與Western-blot檢測細胞中靶分子Fcnb的表達變化。3.利用熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH )確定 lncRNA AK036396在G-MDSCs細胞中定位;利用RNA pull down與RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)實驗確認 lncRNA AK036396與Fcnb蛋白是否存在結(jié)合;利用特異性siRNA敲減G-MDSCs中l(wèi)ncRNA AK036396后,加入蛋白合成抑制劑環(huán)已酰亞胺(Cycloheximide, NCX )(40μg/mL),隨后利用 Western-blot 確認 lncRNAAK036396 對 Fcnb 蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控;利用特異性siRNA敲減G-MDSCs中l(wèi)ncRNA AK036396后,加入蛋白酶體抑制劑MG132 (20pM),隨后利用Western-blot確認lncRNAAK036396對Fcnb蛋白穩(wěn)降解的調(diào)控;利用特異性siRNA敲減G-MDSCs中l(wèi)ncRNA AK036396后,隨后通過免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)實驗確認lncRNAAK036396對Fcnb蛋白泛素化的調(diào)控。4.為了確認Fcnb與G-MDSCs發(fā)育及功能的聯(lián)系,利用小鼠Fcnb特異性siRNA敲減腫瘤組織來源G-MDSCs中Fcnb后,檢測①利用qRT-PCR檢測細胞中CD244的表達;②G-MDSCs免疫抑制功能變化,其中包括:利用比色法檢測精氨酸酶1 (Arginase1,Arg1)活性、利用3H-TdR摻入實驗確認G-MDSCs對T細胞增殖的抑制作用、利用流式細胞術(Flow cytometry, FCM)檢測活性氧(Reactive oxygen species, ROS)表達。5.腫瘤局部注射小鼠Fcnb特異性siRNA后,①連續(xù)監(jiān)測腫瘤生長情況;②使用FCM檢測腫瘤組織中G-MDSCs比例;③利用qRT-PCR檢測腫瘤來源G-MDSCs中CD244表達情況;④腫瘤局部G-MDSCs免疫抑制分子表達變化,其中包括:利用比色法檢測Arg1活性、利用FCM檢測ROS表達;⑤FCM檢測脾臟、引流淋巴結(jié)、腫瘤局部CD3+CD4+IFN-γ+ T細胞和CD3+CD8+IFN-γ+ T細胞比例。6.為了確定lncRNA AK036396對G-MDSCs發(fā)育及功能的調(diào)控,利用小鼠lncRNA AK036396特異性siRNA敲減腫瘤組織來源G-MDSCs中l(wèi)ncRNAAK036396后,①檢測G-MDSCs發(fā)育變化,其中包括:使用qRT-PCR和Western-blot檢測Fcnb的表達、使用qRT-PCR檢測CD244的表達、通過瑞氏-吉姆薩染色檢測細胞形態(tài)學改變;②檢測G-MDSCs免疫抑制功能變化,其中包括:利用比色法檢測Arg1活性、利用3H-TdR摻入實驗確認G-MDSCs對T細胞增殖的抑制作用、利用FCM檢測ROS表達。7.腫瘤局部注射小鼠lncRNA AK036396特異性siRNA后,①連續(xù)監(jiān)測腫瘤生長情況;②FCM檢測腫瘤組織中G-MDSCs比例;③利用qRT-PCR與Western-blot檢測腫瘤局部G-MDSCs中Fcnb的表達,利用qRT-PCR檢測腫瘤局部G-MDSCs中CD244的表達;④腫瘤局部G-MDSCs免疫抑制分子表達變化,其中包括:利用比色法檢測Arg1活性、利用3H-TdR摻入實驗確認G-MDSCs對T細胞增殖的抑制作用、利用FCM檢測ROS表達;⑤FCM檢測脾臟、引流淋巴結(jié)、腫瘤局部 CD3+CD4+IFN-γ+ T 細胞和 CD3+CD8+IFN-γ+ T 細胞比例。8.利用qRT-PCR檢測肺癌患者外周血單個核細胞(PBMCs)中小鼠Fcnb同源物M-ficolin的表達水平,并分析M-ficolin的表達水平與肺癌發(fā)展之間的聯(lián)系。結(jié)果:1.與野生型小鼠脾臟來源CD11b+Ly6G+細胞相比,lncRNAAK036396在腫瘤來源G-MDSCs中高表達(P0.001);與外周成熟中性粒細胞(P0.001)、單核細胞(P0.001)以及腫瘤來源 M-MDSCs (P0.001)相比,lncRNAAK036396 在荷瘤小鼠腫瘤來源G-MDSCs中高表達;lncRNAAK036396的表達隨著G-MDSCs分化發(fā)育逐漸下降(P0.05)。2.與野生型小鼠脾臟來源CD11b+Ly6G+細胞相比,Fcnb在腫瘤來源G-MDSCs中高表達(P0.01);與外周成熟中性粒細胞(P0.001)、單核細胞(P0.001)以及腫瘤來源M-MDSCs (P0.001)相比,Fcnb在荷瘤小鼠腫瘤來源G-MDSCs中的表達水平最高;在腫瘤組織來源G-MDSCs中l(wèi)ncRNAAK036396表達被抑制后,FcnbmRNA (P0.05)與蛋白(P0.05)表達發(fā)生顯著下調(diào)。3.通過FISH實驗發(fā)現(xiàn)lncRNAAK036396主要位于腫瘤來源G-MDSCs細胞核中;通過RNA pull down和RIP實驗證實lncRNAAK036396與Fcnb蛋白之間存在相互結(jié)合;Western-blot結(jié)果顯示在抑制G-MDSCs中l(wèi)ncRNAAK036396表達后,Fcnb蛋白穩(wěn)定性顯著下調(diào);Western-blot結(jié)果顯示在抑制蛋白酶體活性后,siAK036396無法繼續(xù)下調(diào)Fcnb蛋白穩(wěn)定性;IP結(jié)果顯示,抑制lncRNAAK036396表達后,Fcnb蛋白結(jié)合的泛素水平顯著升高。4.利用小鼠Fcnb特異性siRNA敲減腫瘤組織來源G-MDSCs中Fcnb后,①CD244的表達顯著下調(diào)(P0.01);②Arg1活性顯著下調(diào)(P0.05)、ROS表達顯著下調(diào)(P0.05)、G-MDSCs對CD4+T細胞增殖的抑制作用下調(diào)(P0.05)。5.腫瘤局部注射小鼠Fcnb特異性siRNA后,①腫瘤生長被有效延緩(P0.05);②腫瘤組織中G-MDSCs比例發(fā)生顯著下調(diào)(P0.05);③腫瘤來源G-MDSCs中CD244的表達顯著下降(P0.05);④腫瘤局部來源G-MDSCs中Arg1活性(P0.01)、ROS表達(P0.05)均發(fā)生顯著下調(diào);⑤脾臟(P0.05)、腫瘤局部(P0.05) CD3+CD4+IFN-γ+T細胞比例出現(xiàn)顯著上調(diào)。同時,脾臟(P0.05)、腫瘤局部(P0.05) CD3+CD8+IFN-γ+T細胞比例出現(xiàn)顯著上調(diào)。6.在腫瘤組織來源G-MDSCs中l(wèi)ncRNAAK036396表達被抑制后,①Fcnb(P0.05)和CD244 (P0.01)表達均發(fā)生顯著下調(diào),G-MDSCs形態(tài)學特點由桿狀核為主分頁核少見轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘁姺猪摵?②Arg1活性顯著下調(diào)(P0.05)、G-MDSCs對CD4+T細胞增殖的抑制作用下調(diào)(P0.05),但是ROS的表達未出現(xiàn)顯著變化(ns=no significance)。7.腫瘤局部注射小鼠lncRNA AK036396特異性siRNA后,①腫瘤生長被有效延緩(P0.001);②腫瘤組織中G-MDSCs比例發(fā)生顯著下調(diào)(P0.01);③腫瘤局部來源G-MDSCs中Fcnb (P0.01)與CD244 (P0.001)的表達顯著下調(diào);④腫瘤局部來源G-MDSCs中Arg1活性(P0.05)與ROS的表達(P0.001)發(fā)生顯著下調(diào);⑤脾臟(ns)、引流淋巴結(jié)(ns)、腫瘤局部(ns) CD3+CD4+IFN-γ+T細胞比例未出現(xiàn)顯著變化。但是脾臟(P0.05)、引流淋巴結(jié)(P0.05)、腫瘤局部(P0.05) CD3+CD8+IFN-γ+T細胞比例均出現(xiàn)顯著升高。8.與健康對照相比較,肺癌患者PBMCs中M-ficolin (小鼠Fcnb的同源物)的表達水平顯著升高(P0.05)。肺癌患者PBMCs中M-ficolin表達水平與MDSCs比例及Arg1表達水平呈現(xiàn)明顯的正相關(P0.01, P0.05)。且M-ficolin的表達水平與腫瘤大小(P0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.001)、TNM分期(P0.05)密切相關。結(jié)論:LncRNAAK036396在腫瘤來源G-MDSCs中的表達呈現(xiàn)階段特異性與細胞特異性。LncRNAAK036396通過Fcnb能夠有效調(diào)控G-MDSCs免疫抑制功能進而影響機體抗腫瘤免疫。
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【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.51

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本文編號：1754217