發(fā)布時間：2018-04-12 22:30

  本文選題：基因共表達 + 模塊��； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：腫瘤骨轉(zhuǎn)移是受多個因素調(diào)控的,通過嚴格調(diào)控腫瘤細胞與骨微環(huán)境中細胞的基因表達之間的相互作用來實現(xiàn)。miRNA可以作為基因表達的主要調(diào)控因子,參與控制骨轉(zhuǎn)移形成的多個方面,包括從原發(fā)性腫瘤部位逃逸的癌細胞,癌細胞向骨髓的傳播和骨髓的侵襲,以及二次生長和腫瘤間質(zhì)細胞相互作用。在臨床中,在骨形成細胞中已經(jīng)鑒定了一些特異性的miRNA,因此提示miRNA可以用作腫瘤骨轉(zhuǎn)移生物標志物的可能性。miRNA在骨微環(huán)境中的調(diào)節(jié)活性也表明miRNA可能是有希望的治療靶點。研究目標為:(1)共表達分析揭示骨轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因模塊;(2)肺癌骨轉(zhuǎn)移患者中溶酶體下調(diào)及基因表達特征(3)篩選在肺癌骨轉(zhuǎn)移的骨組織中差異表達的miRNA;(4)鑒定在骨轉(zhuǎn)移時對破骨細胞功能有著重要調(diào)控作用的miRNA;(5)闡明該miRNA對破骨細胞分化、生長和成熟進行調(diào)控的信號通路和分子機制。方法:(1)我們利用WGCNA分析了共表達模塊,并研究了共表達基因功能富集的重要模塊。首先,在20個骨轉(zhuǎn)移樣本中對6,922個基因構(gòu)建共表達模塊。然后,使用WGCNA算法分析成對模塊之間的中樞基因的相互作用關(guān)系。之后,對骨轉(zhuǎn)移共表達模塊中的基因進行功能注釋分析。(2)我們對骨髓陰性和骨髓陽性標本的基因表達進行了分析。此外,通過構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡,以找出這些差異表達基因之間的調(diào)控關(guān)系(DEGS)。用基因本體論(GO)和途徑富集分析法對功能富集的生物過程和途徑進行了分析。此外,從構(gòu)建的蛋白-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡中篩選出核心蛋白。(3)從臨床隊列收集肺癌骨轉(zhuǎn)移患者3例,脊柱損傷患者3例,從臨床手術(shù)中收取肺癌骨轉(zhuǎn)移骨組織標本,應用miRNA微陣列技術(shù)及qRT-PCR驗證,分析了不同組別中miRNAs的表達譜差異,并對候選miRNA進行相關(guān)驗證。本實驗懫用丹麥EXIQON公司生產(chǎn)的LNATM mi RNA芯片(11.0版),每張芯片中包含1807個特異性探針、435個特有的探針。為保證結(jié)果的可靠性,上述每個探針在芯片內(nèi)重復4次,即每張芯片對同一樣本重復檢測4次。所得數(shù)據(jù)用Genepix 6.0軟件分析掃描結(jié)果。我們定義腫瘤組相對對照組表達水平大于2或小于0.5的為差異表達。(4)針對hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b基因設(shè)計各兩條具有不同GC%的sgRNA,隨后分別將它們構(gòu)建入sgRNA表達載體和Cas9蛋白/sgRNA共表達載體。其中Cas9蛋白/sgRNA共表達載體能夠同時表達sgRNA和Cas9蛋白,從而實現(xiàn)sgRNA和Cas9蛋白的共傳遞。分別將構(gòu)建好的表達載體利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞中,通過T7E1 assay和DNA測序的方法檢測其剪切效率。結(jié)果證明實驗所設(shè)計的CRISPR/Cas系統(tǒng)的確能夠在hsa-miR-30d、hsa-mi R-154、hsa-miR-34b靶點起作用,并且揭示不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)對靶點剪切效率有所差異。為了整體敲除hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b基因,我們將打靶載體和CRISPR/Cas系統(tǒng)載體一同轉(zhuǎn)染細胞,通過同源重組修復將hsa-miR-30d、hsa-mi R-154、hsa-miR-34b整個基因進行整體替換敲除,再利用嘌呤霉素抗性篩選的方法得到hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b敲除細胞。利用Real-Time PCR對hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b基因拷貝數(shù)檢測以及測定細胞生長速度的方法比較hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b敲除細胞和野生型細胞間的差異。(5)根據(jù)我們前期所進行的在線生物信息學分析發(fā)現(xiàn)mir-154參與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路,DKK2蛋白對Wnt/β-catenin信號通路抑制特異性高,mir-154在Wnt/β-catenin信號通路存在特異性的DKK2靶基因。mir-154是通過堿基互補配對的方式識別DKK2的3’端非編碼區(qū)(Untranslated region,3’-UTR)來降解或阻遏DKK2的翻譯和表達。轉(zhuǎn)染mir-154模擬物或mir-154抑制物到Raw264.7細胞,通過Western blot分析對這些轉(zhuǎn)染細胞的DKK2的表達水平進行檢測。通過生物信息學預測DKK2與mir-154在3’-UTR序列的結(jié)合靶點,通過點突變技術(shù)制備了突變型的3’-UTR序列,把突變型的3’-UTR和野生型的3’-UTR克隆到psiCHECK-2質(zhì)粒。含有突變型的3’-UTR和野生型的3’-UTR的psiCHECK-2質(zhì)粒與mir-154轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中,用雙熒光素分析的方法來檢測其熒光強度。(6)通過在Raw264.7細胞過表達Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白,借助抗酒石酸酸性磷酸酶染色,以及利用Wesrtern Blot的方法檢測抗酒石酸酸性磷酸酶和組織蛋白酶K這兩種破骨細胞分化成熟的特異性標志物,分析Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白與Raw264.7細胞分化成熟的關(guān)系。結(jié)果(1)前5個模塊的功能富集顯示出很大差異,模塊2富集了細胞粘附,ECM受體反應和細胞粘附分子。然后我們推斷出模塊中的兩個基因是與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要基因。(2)篩選出肺部骨轉(zhuǎn)移中的差異表達基因(DEGs)和功能蛋白,表明CTSS,CTSD,MX1,NKX2-1可能在骨轉(zhuǎn)移中起決定性作用。(3)我們通過對3例肺癌骨轉(zhuǎn)移患者與3例非肺癌骨轉(zhuǎn)移患者進行全基因芯片檢測,聚類分析得到下調(diào)的共有82種,上調(diào)的共有112種。通過生物信息學預測分析,我們得到hsa-miR-30d、hsa-mi R-154、hsa-miR-34b在肺癌骨轉(zhuǎn)移的骨組織中低表達。隨后我們使用實時定量PCR法對上述miRNAs在肺癌骨轉(zhuǎn)移的骨組織中組織中進行驗證。結(jié)果顯示,與對照組比較,肺癌骨轉(zhuǎn)移的骨組織中hsa-miR-30d、hsa-mi R-154、hsa-miR-34b等miRNAs表達顯著下降(P0.01),其中以hsa-miR-154最為明顯,其可能是調(diào)控肺癌骨轉(zhuǎn)移的骨組織中相當保守的小RNA,影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。(4)T7E1酶切實驗證實hsa-miR-30d基因片段經(jīng)酶切后,能夠觀察到250 bp和360bp的小片段,hsa-miR-154基因片段被酶切后產(chǎn)生240bp和480bp的片段,hsa-miR-34b基因片段被酶切成220bp和520bp的片段。表明本實驗針對hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b基因設(shè)計的CRISPR/Cas系統(tǒng)可以識別并敲除靶基因。經(jīng)CRISPR/Cas系統(tǒng)處理過的細胞,對hsa-mi R-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b基因位點測序后發(fā)現(xiàn),切割位點處的序列變得非�；靵y無序。表明本實驗設(shè)計的CRISPR/Cas系統(tǒng)可以有效的介導靶位點基因敲除。(5)通過Western blot分析,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了mir-154模擬物的Raw264.7表達出了更低水平的DKK2。相反地,轉(zhuǎn)染了MIR-154抑制物的細胞表達了更高水平的DKK2蛋白。通過點突變技術(shù)制備了突變型的3’-UTR序列轉(zhuǎn)染后,突變型的3’-UTR序列不與mir-154結(jié)合,野生型的3’-UTR序列與MIR-154結(jié)合。把突變型的3’-UTR和野生型的3’-UTR克隆到psiCHECK-2質(zhì)粒。含有突變型的3’-UTR和野生型的3’-UTR的psiCHECK-2質(zhì)粒與mir-154轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中,用雙熒光素分析的方法來檢測其熒光強度。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了野生型質(zhì)粒和mir-154的HEK-293T細胞熒光強度明顯低于對照組,而轉(zhuǎn)染了突變型質(zhì)粒和mir-154的HEK-293T細胞熒光強度與對照組無顯著差異。(6)抗酒石酸酸性磷酸酶染色和Western Blot的方法檢測抗酒石酸酸性磷酸酶和組織蛋白酶K這兩種破骨細胞分化成熟的特異性標志物。結(jié)果酸性磷酸酶和組織蛋白酶K這兩種破骨細胞分化顯示,Ad-β-catenin+RANKL組沒有觀察到TRAP陽性多核細胞;空白組可見少許TRAP陽性多核細胞;而添加了誘導因子的RANKL組、Ad-GFP+RANKL組中TRAP陽性多核細胞明顯增多。Western Blot結(jié)果表明所有組都能檢測到一條顯色帶但是Ad-β-catenin+RANKL組的顯色帶比其余三組都要淺。這些結(jié)果都證實了Wnt/β-catenin信號通路直接調(diào)控破骨細胞的分化成熟過程,并且這種調(diào)控作用為是抑制性的。結(jié)論(1)我們的研究結(jié)果提供了骨轉(zhuǎn)移共表達基因模塊的框架,并在功能方面進一步加深了對這些模塊的理解。(2)證明肺癌骨轉(zhuǎn)移將導致溶酶體功能的變化,影響老骨基質(zhì)的分解和消除,從而影響骨轉(zhuǎn)換。此外,我們的研究結(jié)果也為骨轉(zhuǎn)移的預測和治療提供了新的見解。(3)我們首次篩選并鑒定了肺癌骨轉(zhuǎn)移后骨組織中差異表達的miRNA譜系特征,篩選并驗證了hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b在肺癌骨轉(zhuǎn)移骨組織中低表達;(4)通過CRISPR/Cas系統(tǒng)驗證了miRNA154在Raw264.7細胞的分化成熟中發(fā)揮了重要作用;(5)證實了mir-154可以通過直接抑制DKK2的翻譯和表達從而上調(diào)β-連環(huán)蛋白的表達水平,進而激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路。(6)證實了Wnt/β-catenin信號通路直接調(diào)控破骨細胞的分化成熟過程,并且是抑制作用
[Abstract]:Methods : ( 1 ) The expression profiles of genes in bone marrow - negative and bone marrow - positive specimens were analyzed . The expression vector of hsa - miR - 30d , hsa - mi R - 154 , hsa - miR - 34b was transfected into mammalian cells by homologous recombination . The results showed that the expression of hsa - miR - 30d , hsa - mi R - 154 , hsa - miR - 34b in bone tissue of lung cancer was significantly lower than that of control group . Conclusion ( 1 ) The results of this study provide new insights into the differentiation and maturation of bone metastasis in lung cancer .

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：1741730