本文選題：膠質(zhì)瘤干細胞 + PAX3��； 參考：《蘇州大學》2016年博士論文

【摘要】：第一部分 轉(zhuǎn)錄因子PAX3在膠質(zhì)瘤干細胞中的表達及生物學作用背景與目的轉(zhuǎn)錄因子PAX3作為配對盒轉(zhuǎn)錄子家族一員,其不僅在神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,而且在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。我們前期工作中發(fā)現(xiàn)PAX3在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中呈高表達,且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度密切相關。膠質(zhì)瘤干細胞作為種子細胞是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、治療失敗和復發(fā)的根源。本部分旨在研究轉(zhuǎn)錄因子PAX3在人腦膠質(zhì)瘤干細胞中表達及對人腦膠質(zhì)瘤干細胞凋亡、增殖、侵襲及分化等生物學行為的影響,進一步探討其在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。方法 1、對人腦膠質(zhì)瘤干細胞系GSC11進行細胞培養(yǎng)及干細胞鑒定。通過單克隆實驗驗證膠質(zhì)瘤干細胞的克隆形成能力；2、采用實時熒光定量PCR (RT-PCR)與免疫印跡技術(Western Blot)檢測人腦膠質(zhì)瘤干細胞系GSC11、人腦膠質(zhì)瘤細胞系U87及人腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞系1800中轉(zhuǎn)錄因子PAX3的表達；3、通過轉(zhuǎn)染PAX3真核過表達質(zhì)粒及小分子干擾RNA技術(siRNA)分別對GSC11細胞中轉(zhuǎn)錄因子PAX3進行過表達和干擾表達,采用RT-PCR和Western Blot檢測過表達和干擾效果。采用Western Blot檢測干擾PAX3表達后對膠質(zhì)瘤干細胞標志物CD133及Nestin表達的影響。流式細胞儀檢測GSC11細胞凋亡率；CCK-8法檢測GSC11細胞增殖能力；微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)(Transwell小室實驗)檢測GSC11細胞侵襲能力；建立膠質(zhì)瘤干細胞誘導分化模型,采用細胞免疫熒光法檢測對GSC11細胞分化的影響。結(jié)果1、細胞免疫熒光檢測顯示GSC11細胞中CD133和Nestin表達陽性,單克隆實驗證實細胞具有良好的克隆形成能力,懸浮生長的膠質(zhì)瘤干細胞聚集成球；2、RT-PCR與Western Blot發(fā)現(xiàn)GSC11細胞與U87細胞中PAX3的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于1800細胞。3、轉(zhuǎn)染或者干擾后GSC11細胞中的PAX3的mRNA及蛋白表達水平較對照組明顯增高或者降低。4、干擾PAX3表達后GSC11細胞中CD133及Nestin表達水平明顯下降。5、過表達PAX3后明顯抑制GSC11細胞凋亡,細胞增殖能力明顯增強,且細胞侵襲能力顯著提高；而抑制PAX3表達則明顯促進GSC11細胞凋亡,細胞增殖能力明顯下降,且細胞侵襲能力顯著降低；6、細胞免疫熒光法發(fā)現(xiàn)過表達PAX3的GSC11細胞分化明顯減弱,GFAP陽性細胞率顯著降低；而抑制PAX3表達的GSC11細胞分化明顯增強,GFAP陽性細胞率顯著升高。膠質(zhì)瘤干細胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因子PAX3表達與GFAP陽性細胞數(shù)呈負相關。結(jié)論轉(zhuǎn)錄因子PAX3在膠質(zhì)瘤干細胞中呈高表達。轉(zhuǎn)錄因子PAX3表達與膠質(zhì)瘤干細胞生物學行為密切相關。抑制PAX3的表達可促進膠質(zhì)瘤干細胞凋亡與分化,抑制膠質(zhì)瘤干細胞增殖與侵襲能力。轉(zhuǎn)錄因子PAX3有望成為膠質(zhì)瘤干細胞治療新的靶分子。第二部分轉(zhuǎn)錄因子PAX3對膠質(zhì)瘤干細胞中膠質(zhì)纖維酸性蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制背景與目的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是星形膠質(zhì)細胞中主要的中間纖維素蛋白,參與構(gòu)成細胞骨架,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多能干細胞向星形細胞分化的過程中起著關鍵作用,GFAP基因表達功能狀態(tài)對于膠質(zhì)瘤細胞的生物學功能也有重要影響。本文第一部分研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤干細胞向星型膠質(zhì)細胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因子PAX3與GFAP陽性細胞率呈負相關。本部分旨在進一步研究轉(zhuǎn)錄因子PAX3對膠質(zhì)瘤干細胞中GFAP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。方法1、采用RT-PCR與Western Blot檢測人腦膠質(zhì)瘤干細胞系GSC 11、人腦膠質(zhì)瘤細胞系U87及人腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞系1800中GFAP的表達；2、RT-PCR與Western Blot檢測轉(zhuǎn)染過表達PAX3及siRNA干擾降低PAX3表達后GSC11細胞中GFAP表達,并分析PAX3與GFAP表達相關性；3、通過染色質(zhì)免疫共沉淀法(ChIP Assay)檢測轉(zhuǎn)錄因子PAX3在GSC11細胞中與GFAP基因啟動子相應區(qū)域結(jié)合情況；4、予以構(gòu)建正常及突變的人GFAP啟動子報告基因質(zhì)粒,通過熒光素酶報告分析系統(tǒng)(Luciferase Assay)檢測轉(zhuǎn)錄因子PAX3對GFAP基因啟動子相應結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性；5、依據(jù)測得的GFAP基因啟動子PAX3轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點來設計探針序列,采用電泳遷移率試驗(EMSA)進一步驗證轉(zhuǎn)錄因子PAX3與GFAP基因啟動子相應位點結(jié)合情況。結(jié)果1、RT-PCR與Western Blot發(fā)現(xiàn)GSC11細胞與U87細胞中GFAP的mRNA和蛋白表達水平明顯低于1800細胞；2、轉(zhuǎn)染過表達PAX3后GSC11細胞中GFAP的mRNA和蛋白表達水平明顯下降,而siRNA干擾降低PAX3表達后GSC11細胞中GFAP的mRNA和蛋白表達水平明顯增加。膠質(zhì)瘤干細胞中轉(zhuǎn)錄因子PAX3表達與GFAP表達呈負相關；3、ChIP實驗結(jié)果證實轉(zhuǎn)錄因子PAX3在GSC11細胞中能與GFAP基因啟動子相應區(qū)域結(jié)合；4、在成功構(gòu)建正常與突變的GFAP啟動子報告基因質(zhì)粒后,通過Luciferase Assay檢測發(fā)現(xiàn)過表達PAX3后正常GFAP啟動子報告基因熒光素酶活性較對照組明顯提高。P1位點突變的GFAP啟動子報告基因熒光素酶活性明顯下降,而P2位點突變的GFAP啟動子報告基因熒光素酶活性無明顯下降。轉(zhuǎn)錄因子PAX3對GFAP基因啟動子具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,且P1為其轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點；5、EMSA實驗進一步證實了轉(zhuǎn)錄因子PAX3能與GFAP基因啟動子結(jié)合位點P1特異性結(jié)合。結(jié)論膠質(zhì)瘤干細胞中轉(zhuǎn)錄因子PAX3表達與GFAP表達呈負相關。轉(zhuǎn)錄因子PAX3通過與膠質(zhì)瘤干細胞中的GFAP基因啟動子區(qū)域特異性結(jié)合,對GFAP基因表達起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
[Abstract]:The expression of the first partial transcription factor PAX3 in human glioma stem cells and its biological function background and the target transcription factor PAX3 play an important role in the development of glioma .
2 . The expression of transcription factor PAX3 in human glioma stem cell line GSC11 , human glioma cell line U87 and human brain glioma cell line 1800 was detected by real - time fluorescence quantitative PCR ( RT - PCR ) and Western Blot .
3 . After transfection of PAX3 eukaryotic overexpression plasmid and small interfering RNA technology ( siRNA ) , the expression and interference of PAX3 in GSC11 cells were detected by RT - PCR and Western Blot . Western Blot was used to detect the effect of PAX3 expression on the expression of CD133 and Nestin in glioma stem cells .
CCK - 8 method was used to detect the proliferation of GSC11 cells .
The cell invasion ability of GSC11 cells was detected by a micro - filtration membrane culture chamber and a dual - chamber combined culture system ( Transwell chamber experiment ) .
The differentiation model of glioma stem cells was established . The effect of cell immunofluorescence was used to detect the differentiation of GSC11 cells . Results 1 . The expression of CD133 and Nestin in GSC11 cells was positive by immunofluorescence assay .
2 銆，

本文編號：1734961