本文選題：microRNA-320a(miR-320a) + 水通道蛋白4(AQP-4)�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤,是神經(jīng)外科常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,同時也是治療難度最大的疾病之一。膠質(zhì)瘤具有惡性程度高、侵略性極強以及易復(fù)發(fā)等特點,而其本質(zhì)上是一種多基因異常的疾病,通過過表達原癌基因,伴隨抑癌基因的突變、缺失,使得腫瘤細胞逃避了細胞的正常生存機制。直至目前為止,臨床上采用手術(shù)、物理放射性治療以及聯(lián)合藥物化療等方法治療惡性膠質(zhì)瘤,盡管上述治療方法都有了很大的進步,但患者的預(yù)后仍然不理想。隨著對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究不斷推進,大量研究已揭示了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)機制以及膠質(zhì)瘤干細胞的存在,并對同一病人的腫瘤或不同患者的相同類型腫瘤進行了分子異質(zhì)性的描述。因此,在腫瘤細胞分子水平,針對其分子病理機制進行研究,從腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程尋找突破點,是開發(fā)出更有效、更精準、更快捷的腫瘤治療方案的關(guān)鍵所在。miRNAs是非編碼RNA家族中的一種,具有18-25個核苷酸,在轉(zhuǎn)錄后水平進行基因調(diào)控。研究已確認miRNAs在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,調(diào)控著許多與腫瘤發(fā)病相關(guān)的信號通路,并在惡性膠質(zhì)瘤的進展、細胞侵襲、腫瘤生長和治療反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Micro RNA-320a(miR-320a)位于染色體8p21.3,在肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中均異常低表達,并且研究已表明其具有多種細胞生物作用,如調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及遷移侵襲等。miR-320a在腫瘤中具有多個靶點基因,也相繼得到了實驗驗證,而在膠質(zhì)瘤中的作用和功能仍需要進一步的探索和發(fā)現(xiàn)。水通道蛋白4(AQP-4)是水通道蛋白家族中的一員,具有在腦組織中特別富集的特點,并在不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域發(fā)揮不同的功能。最初AQP-4被定義為一種純粹的水分子運送蛋白,在腦組織中參與了組織水腫、細胞水的調(diào)節(jié)及腦脊液的形成。然而,AQP-4的細胞生物學(xué)功能不僅如此,它還能富集在膠質(zhì)細胞終足上,參與細胞膜的解離與重組,在細胞延伸與運動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。值得注意的是,基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)同樣具有促進細胞侵襲和遷移的功能。因此,我們提出假設(shè):miR-320a是否能調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲和遷移,以及AQP-4、MMP-9在此過程中發(fā)揮什么作用?目的本研究以人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤U87、U251細胞株為研究對象,觀察miR-320a對細胞侵襲遷移的影響。以生物信息學(xué)分析為基礎(chǔ),探討miR-320a的作用機制,以及AQP-4、MMP-9在此過程中發(fā)揮的作用。通過實驗分析,為臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供更多的理論依據(jù)和藥物靶點參考。方法生物信息學(xué)分析CGGA(Chinese Glioma Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫,分析miR-320a在高級別和低級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤的表達差異以及高低表達miR-320a的總生存率的差異;用miRBase、Targetscan和micro RNA.org進行miR-320a靶點預(yù)測,分析出miR-320a在AQP-4 m RNA 3’-UTR結(jié)合區(qū)域,化學(xué)合成序列、構(gòu)建質(zhì)粒進行雙熒光素酶報告基因驗證;腦膠質(zhì)瘤組織切片免疫組織化學(xué)染色鑒定AQP-4的表達水平;體外培養(yǎng)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U87、U251,分別進行miR-320a及miRNA negative control(miR-NC)mimics轉(zhuǎn)染,48小時后q PCR檢測轉(zhuǎn)染效率,Transwell實驗分析細胞遷移侵襲能力,q PCR和Western Blot檢測AQP-4及MMP-9 m RNA和蛋白水平的表達情況、免疫熒光檢測AQP-4蛋白表達情況;對AQP-4基因進行干擾,q PCR和Western Blot檢測AQP-4基因干擾后m RNA和蛋白表達水平,Transwell實驗分析基因干擾后侵襲和遷移能力。結(jié)果1.CGGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示:miR-320a在WHOⅣ和Ⅲ級膠質(zhì)瘤中的表達水平明顯低于WHOⅡ級膠質(zhì)瘤,并且高表達miR-320a組的總生存率也明顯高于低表達miR-320a組。2.預(yù)測靶點分析:AQP-4 m RNA 3’-UTR 2000 bp內(nèi)有3個miR-320a結(jié)合靶點。經(jīng)過雙熒光素酶報告基因的分析驗證,其中848-870 bp區(qū)域為miR-320a的有效結(jié)合區(qū)域。3.臨床標本組織切片分析:對正常腦組織及WHOⅡ和WHOⅣ膠質(zhì)瘤組織進行HE和IHC染色分析。HE染色結(jié)果顯示:與正常腦組織相比較,Ⅳ級腫瘤組織中腫瘤細胞異型性明顯,有瘤巨細胞形成、核大小不一、染色質(zhì)豐富,有核分裂象。IHC結(jié)果顯示,AQP-4在膠質(zhì)瘤組織中高表達和極性分布,且與腫瘤WHO分級呈正比。4.miR-320a過表達轉(zhuǎn)染實驗:U87和U251細胞株分別轉(zhuǎn)染miR-320a和miR-NC mimics,q PCR結(jié)果顯示:與miR-NC和空白對照組相比miR-320a mimic組中miR-320a的表達量顯著增高,而miR-NC組與空白對照組無明顯差異。Transwell功能實驗分析結(jié)果顯示:過表達miR-320a后能明顯抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。5.q PCR和WB結(jié)果顯示:過表達miR-320a能顯著降低AQP-4m RNA和蛋白水平的表達,MMP-9的表達則無明顯變化。6.q PCR和WB結(jié)果顯示:AQP-4 si RNA轉(zhuǎn)染后能顯著降低AQP-4 m RNA和蛋白水平的表達,Transwell功能實驗顯示干擾AQP-4的表達能顯著抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。7.免疫熒光結(jié)果顯示:過表達miR-320a和干擾AQP-4后能明顯降低腫瘤細胞AQP-4蛋白的表達。結(jié)論1.miR-320a在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中異常低表達,并且與臨床預(yù)后相關(guān)。2.抑制AQP-4的表達能有效抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲能力。3.miR-320a直接靶向作用AQP-4 m RNA 3’-UTR,抑制其蛋白的表達,并發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲的作用。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.4

【參考文獻】

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2 李小松;唐玲;汪克建;駱世芳;侯良娟;孫善全;冉建華;;水通道蛋白4在小鼠嗅覺系統(tǒng)中的表達及功能[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2011年04期

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4 冉建華,孫善全;水通道蛋白4在大鼠眼球中的表達[J];解剖學(xué)報;2004年06期

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本文編號：1733365