本文選題：腫瘤干細胞 + CD90　； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景肝細胞性肝癌(以下簡稱肝癌)對于放化療均不敏感,手術(shù)切除后復發(fā)率高,常導致肝癌治療的失敗。腫瘤干細胞是腫瘤中一小群具有自我更新、無限增殖、多向分化及轉(zhuǎn)移遷徙特性的細胞,被認為是腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移及放化療耐受的主要原因之一。針對腫瘤干細胞的靶向療法為肝癌治療提供了嶄新思路。目前有多個分子作為表面標志物用于分離肝癌中的腫瘤干細胞,包括CD90,Ep CAM,CD133,CD24、OV-6和CD44,但不清楚哪個標志物更具有普遍性,更適合于臨床應(yīng)用。microRNA(miRNA)是一類非編碼的小RNA,數(shù)量眾多,長度通常在17-27個堿基之間。miRNA主要通過與信使RNA(m RNA)的3’-端非翻譯區(qū)(3’-UTR)發(fā)生堿基互補配對,使得靶m RNA降解或蛋白質(zhì)翻譯受到抑制,由此實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達的負向調(diào)控。在人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)一系列的miRNA參與了腫瘤干細胞群體的維持及干細胞特性的調(diào)控,如增殖、遷移、侵襲及放化療耐受。但是調(diào)控CD90陽性肝癌干細胞的miRNA目前還不清楚。絲裂原活化蛋白3激酶8(MAP3K8)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一個成員,與多種人類腫瘤的形成和進展密切相關(guān)。MAP3K8在腫瘤中的作用有著兩面性,在大多數(shù)腫瘤,例如乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、鼻咽癌、胸腺瘤和淋巴瘤中,MAP3K8都發(fā)揮著促進腫瘤的作用。MAP3K8與NF-κB信號通路有著錯綜復雜的相互調(diào)節(jié)的關(guān)系,而NF-κB在很多腫瘤中都被激活,并參與了腫瘤干細胞的維持、擴增及存活,這些現(xiàn)象提示MAP3K8可能參與了腫瘤干細胞的調(diào)節(jié)。但是在肝癌中,尤其是在肝癌干細胞中,MAP3K8是否發(fā)揮作用以及發(fā)揮何種作用并不清楚。研究方法1通過流式細胞技術(shù)檢測各肝癌干細胞表面標志物在肝癌細胞株中的表達,通過細胞成球?qū)嶒炑芯扛杉毎囵B(yǎng)環(huán)境對于CD90表達的影響。通過q RT-PCR、細胞成球、平板克隆形成、Transwell侵襲小室及裸鼠成瘤驗證CD90陽性肝癌細胞的干細胞特性。2通過miRNA微陣列芯片探索與CD90陽性肝癌干細胞相關(guān)的miRNA,并用q RT-PCR驗證芯片結(jié)果。其中我們選擇了mi R-589-5p作為研究對象,轉(zhuǎn)染mi R-589-5p mimics使其過表達,并探索mi R-589-5p對CD90陽性肝癌干細胞特性的影響。3通過計算機預(yù)測mi R-589-5p下游靶蛋白,利用熒光素酶報告實驗、q RT-PCR及Western blot驗證mi R-589-5p對靶蛋白MAP3K8的直接調(diào)控作用。4利用si RNA干擾MAP3K8的表達,研究MAP3K8對CD90陽性肝癌干細胞特性的影響。5通過免疫組織化學和q RT-PCR分別檢測CD90和mi R-589-5p在原發(fā)性肝癌中的表達,并統(tǒng)計分析CD90和mi R-589-5p的表達對于肝癌患者預(yù)后的影響。研究結(jié)果1在被檢測的肝癌干細胞表面標志物中,只有CD90在各個肝癌細胞株中均有陽性表達,且穩(wěn)定在一個比例較低的水平,即使在細胞成球后仍是如此。CD90陽性肝癌細胞具有肝癌干細胞特性,比如表達干細胞相關(guān)基因,具有更強的自我更新、遷移、侵襲及成瘤能力。2 miRNA微陣列芯片發(fā)現(xiàn),與CD90陰性細胞相比,CD90陽性肝癌細胞中有3個上調(diào)的miRNA以及6個下調(diào)的miRNA。q RT-PCR證實mi R-589-5p和mi R-33b-5p在CD90陽性肝癌細胞中下調(diào)。轉(zhuǎn)染mi R-589-5p mimics可以使mi R-589-5p過表達,并抑制CD90陽性肝癌干細胞特性,包括干細胞相關(guān)基因的表達、自我更新、遷移、侵襲及成瘤能力。3熒光素酶報告基因顯示mi R-589-5p可以與MAP3K8 m RNA的3’-UTR直接結(jié)合。在CD90陽性肝癌干細胞中過表達mi R-589-5p將降低MAP3K8的m RNA和蛋白水平。4轉(zhuǎn)染MAP3K8 si RNA能抑制MAP3K8的表達,并抑制CD90陽性肝癌干細胞特性,包括干細胞相關(guān)基因的表達、自我更新、遷移及侵襲能力。5 CD90在原發(fā)性肝癌組織中均有表達,且表達于一小群肝癌細胞中。mi R-589-5p和CD90的表達量在肝癌組織中呈負相關(guān)。CD90高表達和mi R-589-5p低表達的肝癌患者更容易發(fā)生血管侵犯及術(shù)后復發(fā),且無瘤生存率及總生存率較低,預(yù)后不良。結(jié)論1.CD90是理想的肝癌干細胞標志物,CD90陽性肝癌細胞表達干細胞相關(guān)基因、具有自我更新、遷移、侵襲及體內(nèi)成瘤等肝癌干細胞特性。2.mi R-589-5p可抑制CD90陽性肝癌細胞的腫瘤干細胞特性,在CD90陽性肝癌干細胞中顯著下調(diào)。3.mi R-589-5p通過與MAP3K8 m RNA的3’-UTR結(jié)合,下調(diào)MAP3K8的表達來抑制CD90陽性肝癌細胞的腫瘤干細胞特性。4.原發(fā)性肝癌中普遍表達CD90,其表達量與mi R-589-5p呈顯著負相關(guān)。CD90高表達和mi R-589-5p低表達提示預(yù)后不良。CD90和mi R-589-5p可作為預(yù)測肝癌患者預(yù)后的有效指標。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1731571