本文選題：絡(luò)氨酸激酶抑制劑 + 白血病　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文

【摘要】：急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)中約有三分之一的患者是由于FLT3酪氨酸激酶的突變引起的,其中內(nèi)部串聯(lián)型(Internal Tandem Duplication,ITD)突變患者預后極差。以FLT3為靶點用于治療FLT3突變型AML的藥物開發(fā)是當前研究的熱點之一。AC220(Quizartinib)是目前已知的十分具有開發(fā)潛力的FLT3抑制劑之一,并處于臨床Ⅲ期研究階段。但包括AC220在內(nèi)的許多FLT3抑制劑,尤其是TypeⅡ的FLT3抑制劑,所面臨的主要問題是患者一般服用3個月后會發(fā)生進一步的點突變而產(chǎn)生耐藥性。因此,繼續(xù)尋找具有FLT3抑制活性且對耐藥突變有效的化合物,并詳細闡述藥物作用機制是當前亟需解決的問題,也是本研究的主要目的。本課題前期通過對c-MET激酶抑制劑LS177進行了 46種絡(luò)氨酸激酶抑制作用的體外篩選實驗,發(fā)現(xiàn)LS177同時具有FLT3激酶抑制活性,但隨后發(fā)現(xiàn)LS177對FLT3-ITD突變細胞系MV4-11的抑制活性顯著弱于陽性對照藥AC220。經(jīng)過對一系列化合物的篩選,最終設(shè)計合成并篩選出4-苯氧基喹啉衍生物MZH29。MZH29對體外表達的FLT3-WT和FLT3-ITD激酶具有強的抑制活性,半數(shù)有效抑制濃度(IC50)分別為9 nM和7 nM,活性強度與AC220相同;MZH29同時對FLT3-WT依賴性的AML細胞系和FLT3-ITD突變型細胞系具有抑制作用,在FLT3-ITD突變型白血病細胞系上的IC50均低于1nM。在促凋亡作用實驗中,MZH29同時對FLT3-WT依賴性的AML細胞系和FLT3突變型細胞系具有顯著的促凋亡作用,主要通過促進凋亡蛋白Cleaved Caspase 3和Cleaved PARP的表達上調(diào)。為了明確MZH29對耐藥突變細胞株的抑制作用情況,我們體外構(gòu)建了各種耐藥突變細胞系,結(jié)果表明MZH29對耐藥突變型細胞系,包括FLT3-ITD-F691L,FLT3-D835H/Y/V和FLT3-K663Q突變細胞系的生長均具有很強的抑制作用,且明顯優(yōu)于陽性對照藥AC220,在FLT3-K663Q和FLT3-ITD-F691L突變細胞上的抑制活性強度分別是AC220的47倍和40倍。在信號通路方面,MZH29主要通過抑制FLT3及其下游的STAT5和ERK的磷酸化而抑制細胞的增殖,MZH29對FLT3-ITD-F691L和FLT3-ITD-D835Y耐藥突變細胞系的FLT3及其下游磷酸化信號通路仍然具有抑制作用,表明MZH29能夠用于治療FLT3耐藥突變型的AML。我們通過Docking的方法計算了 MZH29與FLT3的作用方式,MZH29能夠結(jié)合于非活性狀態(tài)FLT3的激酶結(jié)構(gòu)域,并發(fā)現(xiàn)MZH29與FLT3-F691L耐藥突變?nèi)阅苄纬煞�(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象,解釋了 MZH29對耐藥突變有效的作用機制,同時也暗示著MZH29可能屬于TypeⅡ的FLT3抑制。體內(nèi)實驗中,通過構(gòu)建皮下種植瘤和血液瘤兩種模型證實了 MZH29的藥物活性�？诜﨧ZH29 10 mg/kg可以完全抑制小鼠皮下移植瘤生長和顯著延長血液種植瘤模型小鼠的生存期,且具有較低的體內(nèi)毒性。進一步的蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn),與AC220相比較,MZH29作用后對整體蛋白組的表達水平影響較小,二者調(diào)控的蛋白主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性蛋白和DNA結(jié)合蛋白,以及重要的細胞周期蛋白�？傊�,本研究證實MZH29具有作為治療FLT3突變型急性髓性白血病的新型抑制劑的開發(fā)潛力。
[Abstract]:Acute myeloid leukemia (Acute Myeloid, Leukemia, AML) in about 1/3 of patients is due to a mutation of FLT3 tyrosine kinase, including internal tandem type (Internal Tandem Duplication, ITD) mutations in patients with poor prognosis. FLT3 targeted for drug development for the treatment of FLT3 mutant AML is currently one of the hotspots in the Research of.AC220 (Quizartinib) is currently known is the potential inhibitors of FLT3, and in the stage of clinical stage III. But many FLT3 inhibitors including AC220, especially FLT3 inhibitors of Type II, the main problems are generally taking patients after 3 months will further point mutation of drug resistance. Therefore, continue to search with FLT3 inhibitory activity and effective compound mutation on resistance, and expounds the mechanism of drug action is needed to solve the current problems, this study is the The main purpose of this paper. By the early on the c-MET kinase inhibitor LS177 for 46 inhibition of tyrosine kinase in vitro screening experiments, LS177 has found in inhibition of FLT3 kinase activity, but then found that LS177 inhibitory activity of the FLT3-ITD mutant cell line MV4-11 was significantly weaker than the positive control drug AC220. after the screening of a series of compounds the final design, synthesized and screened 4- phenoxy quinoline derivatives MZH29.MZH29 on the in vitro expression of FLT3-WT and FLT3-ITD kinase has strong inhibiting activity, the median effective inhibitory concentration (IC50) were 9 nM and 7 nM, the strength of activity similar to AC220; MZH29 and FLT3-WT dependent AML cell lines and FLT3-ITD mutant cells the Department has inhibitory effect on FLT3-ITD mutant leukemia cell line IC50 were lower than that of 1nM. in the apoptosis experiments, MZH29 dependent AML cells to FLT3-WT And FLT3 mutant cells with apoptosis significantly, mainly through up regulation of apoptosis protein Cleaved Caspase 3 and Cleaved PARP expression. In order to suppress the effect of MZH29 on the clear mutant cell lines in vitro, we construct a variety of mutant cell lines, the results showed that MZH29 of resistant mutant cell lines, including FLT3-ITD-F691L FLT3-D835H/Y/V, FLT3-K663Q mutation and cell growth has a strong inhibitory effect, and significantly better than the positive control drug in AC220, FLT3-K663Q and FLT3-ITD-F691L mutation on the cell inhibitory activity intensity were 47 times and 40 times of the AC220. In the MZH29 signaling pathway, mainly through inhibition of FLT3 and its downstream STAT5 and ERK phosphorylation and inhibition of cell proliferation, FLT3 phosphorylation and downstream signal pathway of FLT3-ITD-F691L cell lines MZH29 and FLT3-ITD-D835Y mutant still Inhibitory effect of MZH29 that can be used for the treatment of FLT3 resistant mutant AML. we through the Docking method to calculate the interaction between MZH29 and FLT3, MZH29 kinase domain can bind to the non active state of FLT3, and found that MZH29 and FLT3-F691L mutant still can form stable binding conformations, explains the mechanism of effective MZH29 the mutant, also implies that MZH29 may belong to Type II FLT3 inhibition. In vivo, by constructing the confirmed drug activity MZH29 subcutaneous tumor and blood tumor model. Two kinds of oral MZH29 10 mg/kg can completely inhibit the growth and prolong the blood tumor model in mice subcutaneous xenograft survival. In vivo and has low toxicity. Further proteomics study found that compared with AC220, has little effect on expression level of whole protein group after MZH29, two The proteins regulated mainly are transcriptional regulation of active protein and DNA binding protein, and important cyclin. In conclusion, this study confirms that MZH29 has potential as a new inhibitor for the treatment of FLT3 mutant acute myeloid leukemia.

【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.71

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本文編號：1731100