本文選題：Nodal　切入點：非小細胞肺癌　出處：《中山大學》2015年博士論文

【摘要】：研究背景肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的一種惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率逐年升高。肺癌中約80-85%為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),主要包括鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌及其他少見的腺鱗癌、類癌和支氣管腺體癌等,臨床中最常見的為前兩者。對于早期非小細胞肺癌,手術(shù)治療仍是首選的治療方法,但約超過一半以上患者在就診時已屬晚期,失去了手術(shù)機會,放化療成為這部分患者的主要治療方法,但五年生存率仍不滿意。隨著對腫瘤分子生物學的不斷深入研究,分子靶向治療(molecular targeted therapy)正逐步成為惡性腫瘤綜合治療不可或缺的一部分。近年來在肺癌分子靶向治療方面研究頗多,部分針對如表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的靶向藥物已被批準已用于晚期肺腺癌患者,在臨床中已取得可觀的療效。靶向治療正引領(lǐng)著肺癌治療逐步走向個體化治療的新里程,因此不斷深入探索新的生物靶點,對肺癌個體化治療及提高五年生存率起著十分重要的意義。上皮間質(zhì)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞失去其上皮特性,獲得了間質(zhì)細胞的特性,從而具備降解細胞外基質(zhì)的能力和較強的遷移能力。越來越多的研究證明,上皮間質(zhì)化被認為是與惡性腫瘤侵襲、遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的一個過程,目前已經(jīng)成為腫瘤靶向治療藥理研究的一個重要靶點。研究表明,與上皮間質(zhì)化緊密相關(guān)的一個信號通路是TGF-β(transforming growth factor,TGF-β)信號通路,而胚胎成形素Nodal蛋白屬于TGF-β信號傳導超家族,原本是一種重要的細胞成形素,能調(diào)控細胞的生長和分化,隨著生長發(fā)育正常組織中表達逐漸減少。然而,研究表明在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中都可以檢測到Nodal蛋白的表達。進一步的研究還發(fā)現(xiàn),Nodal蛋白參與調(diào)控這些惡性腫瘤的增殖、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移,且和預后有密切關(guān)系,故Nodal很可能可以作為影響惡性腫瘤預后的一個重要因素,也可能是惡性腫瘤分子靶向治療中一個新的靶點。目前,Nodal蛋白在肺癌中研究極少,為了解其在肺癌中是否也存在表達,本研究將檢測臨床非小細胞肺癌組織標本中Nodal的表達情況,并分析Nodal的表達與臨床分期、病理分化程度等臨床因素的相關(guān)性,并進行體外細胞實驗,檢測肺腺癌細胞株A549中Nodal的表達情況,以及從上皮間質(zhì)化角度進一步探索Nodal與非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制。第一部分人非小細胞肺癌組織中Nodal蛋白的表達及臨床意義目的:研究Nodal蛋白在人肺鱗狀細胞癌和肺腺癌中的表達及臨床意義。方法:收集我院心胸外科2012年1月~2014年6月肺癌術(shù)后標本94例,其中鱗狀細胞癌24例、腺癌70例,選取肺大泡切除術(shù)后正常肺組織20例作為對照組。采用免疫組織化學染色檢測Nodal蛋白在肺鱗癌、腺癌和正常肺組織中的表達情況,并通過統(tǒng)計學分析了解Nodal蛋白的表達與患者年齡、性別、吸煙史、病理分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及寡轉(zhuǎn)移等臨床相關(guān)因素的相關(guān)性。結(jié)果:免疫組織化學染色結(jié)果顯示,Nodal蛋白在肺鱗狀細胞癌中陽性表達率為33.3%(8/24),對照組陽性表達率為10%(2/20),兩者之間無統(tǒng)計學差異(p0.05);Nodal蛋白在肺腺癌中陽性率為84.3%(59/70),與對照組之間有明顯的統(tǒng)計學差異(p0.05)。在肺腺癌中,中-高分化者和未-低分化者的Nodal蛋白的陽性表達率分為76.7%(33/43)和96.3%(26/27),兩者之間有統(tǒng)計學差異(p0.05);臨床分期為I-II期者和III-IV期者的Nodal陽性表達率分別為71.9%(23/32)和94.7%(36/38),兩者之間有統(tǒng)計學差異(p0.05);伴和不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Nodal陽性表達率分別為92.8%(39/42)和71.4%(20/28),兩者之間有統(tǒng)計學差異(p0.05);伴和不伴寡轉(zhuǎn)移者Nodal陽性表達率為96.2%(25/26)和77.3%(34/44),兩者之間有統(tǒng)計學差異(p0.05)。肺腺癌中男性39例,女性31例,陽性表達率分別為89.8%和77.4%,兩者之間無統(tǒng)計學差異(p0.05);年齡小于50歲者和大于等于50歲者的陽性表達率分別為85.7%和83.7%,兩者之間無統(tǒng)計學差異(p0.05);有和無吸煙史者的陽性表達率分別為76.0%和88.9%,兩者之間無統(tǒng)計學差異(p0.05)。結(jié)論:Nodal蛋白在肺腺癌中的陽性表達率明顯高于正常肺組織,而在肺鱗癌中表達與正常肺組織無差異。在肺腺癌中,Nodal蛋白的陽性表達率與腺癌分化程度、臨床分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和寡轉(zhuǎn)移相關(guān),分化程度越低、臨床分期越晚、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及寡轉(zhuǎn)移,Nodal蛋白的陽性表達率越高;而與患者的年齡、性別及是否吸煙不相關(guān)。第二部分肺腺癌細胞株A549中Nodal蛋白的表達目的:檢測肺腺癌細胞株A549細胞中Nodal蛋白的表達。方法:1、肺腺癌細胞株A549細胞的復蘇、培養(yǎng)及傳代。2、采用傳代培養(yǎng)的A549細胞行免疫細胞化學染色、Western blot,檢測Nodal蛋白表達,以正常肺泡上皮細胞為對照組。結(jié)果:免疫細胞化學染色可見肺腺癌細胞株A549細胞質(zhì)內(nèi)有黃褐色的顆粒物質(zhì),染色中等陽性(++),且陽性細胞多,對照組正常肺上皮細胞染色為陰性,Western blot顯示A549的Nodal蛋白印記為灰色條帶,對照組未見條帶。結(jié)論:Nodal蛋白在肺腺癌細胞A549中高表達,而在正常肺泡上皮細胞中為陰性表達。第三部分Nodal誘導肺腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制目的:探索Nodal誘導肺腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機制。方法:1.通過體外r Nodal干預傳代培養(yǎng)的A549細胞,觀察Nodal誘導的細胞形態(tài)學變化;2.收集經(jīng)體外r Nodal干預培養(yǎng)至12h、24h及48h的A549細胞,提取各時段的總蛋白,行Western blot,分析Nodal刺激后A549細胞上皮標志物E-cadherin及間質(zhì)標志物Vimentin表達的變化趨勢;3.通過細胞劃痕試驗和Transwell細胞侵襲試驗,分析Nodal對A549細胞的遷移和侵襲能力的影響;4.收集通過體外r Nodal干預后培養(yǎng)至15、30及60分鐘的A549細胞,提取各時段的總蛋白,行Western blot,分析Nodal刺激A549細胞三個時段Smad2的磷酸化水平。結(jié)果:1、正常A549細胞呈現(xiàn)多邊形、鵝卵石樣緊密排列生長。經(jīng)r Nodal干預后24h細胞逐漸變成不規(guī)則的狹長、梭形或紡錘形,且有偽足形成,48 h后最明顯,細胞呈渦旋狀排列,且具有一定的時間依賴性。2、上皮標志物E-cadherin的表達隨r Nodal刺激時間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,而間質(zhì)標志物Vimentin的表達則相反呈持續(xù)上升的趨勢。3、劃痕試驗24h開始各組于劃痕區(qū)可見遷移的細胞,48h后r Nodal刺激組遷移細胞的數(shù)目最多,Nodal抑制劑SB組遷移的細胞數(shù)最少,Nodal組遷移細胞的數(shù)目明顯多于對照組(p0.05);Transwell侵襲試驗48h后各組均觀察到腫瘤細胞穿越仿生基底膜,r Nodal組中穿越進入下室生長的細胞數(shù)量比對照組和SB組明顯多(p0.05)。4、通過體外A549細胞進行r Nodal干預后,Smad2的磷酸化蛋白水平在檢測時間內(nèi)隨著時間的推移而逐漸升高。結(jié)論:Nodal可以促進A549細胞發(fā)生形態(tài)學的變化,由上皮向間質(zhì)細胞形態(tài)改變,并有一定的時間依賴性,能促進A549細胞上皮標志物表達減少,間質(zhì)標志物表達增多而介導A549細胞上皮間質(zhì)化,提高A549細胞的遷移和侵襲能力,小分子抑制劑SB431542能抑制其遷移能力,促進Smad細胞信號通路的活化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中山大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：1729378