本文選題：人外周血Vδ1T細胞　切入點：人外周血Vδ2T細胞　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景： 細胞過繼免疫治療被認為是繼手術(shù)、化療、放療之后的腫瘤重要治療手段。近年來的基礎(chǔ)和臨床研究證明,細胞過繼免疫治療能夠與傳統(tǒng)的腫瘤治療方式協(xié)同作用發(fā)揮持續(xù)的抗腫瘤效應(yīng),預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。然而,仍存在免疫細胞難以到達腫瘤局部、免疫耐受、腫瘤免疫抑制微環(huán)境等問題限制腫瘤細胞過繼免疫治療的效果。 人γδT細胞是一類進化上保守的非MHC限制性的固有T淋巴細胞,因其TCR受體δ鏈的不同分為V61γδ6T(Vδ1T)和Vγ9Vδ2γδT(Vδ2T)兩種主要細胞亞型。生理情況下,Vδ2T細胞是人外周血γδT細胞的主要亞群,能在體外殺傷多種來源的腫瘤細胞。由于Vδ2亞群細胞數(shù)量多,體外激活擴增方法成熟,目前基于腫瘤的γδT細胞過繼免疫治療的臨床試驗主要集中在Vδ2T細胞亞群,但其存在體內(nèi)抗腫瘤能力難以持久、對實體腫瘤的效果欠佳等不足。 人Vδ1T細胞主要分布于腸道上皮、皮膚、脾臟和肝臟,在外周血中所占比例很低。最近,Vδ1T細胞被證明能夠體外清除血液系統(tǒng)腫瘤細胞和實體腫瘤尤其是上皮來源腫瘤細胞,也能在體外培養(yǎng)擴增。激活的Vδ1T細胞能在血循環(huán)中持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),有望成為腫瘤的細胞過繼免疫治療的候選細胞亞群。然而人外周血Vδ1和Vδ2T細胞的腫瘤殺傷作用哪個更強、能否殺傷腫瘤干細胞以及如何體外激活擴增獲得大量高純度Vδ1T細胞等尚不清楚。我們試圖以結(jié)腸癌為例研究γδT細胞在腫瘤過繼免疫治療中的作用及機制。 研究方法： 為了明確自然狀態(tài)下人外周血γδT細胞的特征及腫瘤殺傷作用,我們首先通過原代外周血淋巴細胞分離及流式細胞檢測分析健康人外周血中Vδ1和Vδ2T細胞分別占總γδT細胞的比例、CD69的表達水平、細胞表型、細胞因子分泌及趨化因子受體表達等；然后通過結(jié)腸癌細胞低血清培養(yǎng)技術(shù)獲得干細胞樣克隆球細胞并對其干細胞特性包括克隆球形態(tài)、干細胞相關(guān)基因表達、成瘤能力等進行鑒定;最后通過流式細胞分選技術(shù)分離V61和Vδ2T細胞亞群,分別與結(jié)腸癌細胞及其克隆球細胞短期共培養(yǎng),流式細胞檢測比較結(jié)腸癌細胞及其克隆球細胞凋亡情況。 為了研究Vδ1T細胞體外擴增方法及其殺傷腫瘤的機制,我們首先磁珠分選出人外周血總γδT細胞,通過PHA+IL-7體外短期培養(yǎng)擴增14天,流式細胞檢測分析Vδ1T細胞體外培養(yǎng)前后在總γδT細胞中所占的比例并用CFSE法分析其增殖水平；然后用流式細胞檢測分析擴增后Vδ1和Vδ2T細胞表型、細胞因子分泌、趨化因子受體表達情況；同時通過流式細胞分選技術(shù)分離Vδ1和V62T細胞亞群分別與結(jié)腸癌細胞及其克隆球細胞短期共培養(yǎng),流式細胞檢測比較結(jié)腸癌細胞及其克隆球細胞凋亡情況；為了明確Vδ1T細胞的腫瘤殺傷機制,我們通過transwell共培養(yǎng)的方法分析Vδ1T細胞體外殺傷腫瘤細胞的方式；然后通過流式細胞檢測分析Vδ1T細胞及腫瘤細胞表面細胞毒作用相關(guān)分子受體及配體表達情況；最后通過細胞毒作用相關(guān)分子阻斷抗體驗證Vδ1T細胞體外殺傷腫瘤的途徑。 為了闡明Vδ1T細胞體系擴增及其體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)優(yōu)勢,首先我們將PHA+IL-7擴增的總γδT和V61T細胞與傳統(tǒng)Zol+IL-2方法擴增后的總yδT和V62T細胞、PHA+IL-2擴增的總γδT和Vδ1T細胞的體外殺傷腫瘤效應(yīng)進行比較；為了解釋PHA+IL-7促進Vδ1T細胞增殖和存活的優(yōu)勢,我們比較了PHA+IL-7和PHA+IL-2兩種擴增方法中V61T細胞的增殖及存活情況；然后通過ELISA方法檢測了兩種擴增體系中IL-2的分泌量；接著通過IL-2和IL-7中和抗體分析其對Vδ1T細胞增殖和凋亡的影響。最后通過建立人結(jié)腸癌NOD/SCID小鼠移植瘤模型驗證Vδ1T細胞體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。 研究結(jié)果： 1.人新鮮外周血yδT細胞亞群的特征及腫瘤(干)細胞殺傷作用。自然狀態(tài)下健康人外周血γδT細胞以Vδ2T細胞亞群為主,Vδ1T細胞比例僅占1%-10%。人新鮮外周血Vδ1亞群表面細胞活性標記CD69的表達高于Vδ2亞群。此外,Vδ1T細胞高表達CD107a、Perforin、GranzymeB、TRAIL、CD57和HLA-DR,而Vδ2T細胞高表達DNAM-1、CD56、TNF-a和IFN-γ。與Vδ2T細胞比較,Vδ1T細胞還高表達CCR4、CCR6、CCR7、CXCR1、CXCR5和CXCR7。其他細胞表面標記和細胞因子分泌未見明顯差異。 新鮮外周血Vδ1和Vδ2T細胞流式分選純度大于90%。低血清條件下培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞14天后細胞顯示干細胞相關(guān)特性,如具有克隆球形態(tài),高表達腫瘤干細胞相關(guān)基因,小鼠體內(nèi)成瘤能力增強。細胞毒作用實驗顯示,在同樣的效應(yīng)細胞／靶細胞比例下,健康人外周血Vδ1T細胞較同一樣本配對的Vδ2T細胞能夠殺傷更多的結(jié)腸癌細胞及相應(yīng)克隆球細胞。同樣地,結(jié)腸癌病人外周血Vδ1T細胞對結(jié)腸癌細胞也具有較Vδ2T細胞更強的殺傷作用。 2.Vδ1T細胞體外擴增體系的構(gòu)建及其殺傷腫瘤的機制。 磁珠分選γδT細胞純度大于90%,經(jīng)體外PHA+IL-7培養(yǎng)14天后,Vδ1T細胞被選擇性富集擴增,在γδT細胞中所占比例從約10%提高到80%左右,而Vδ2T細胞比例顯著下降。PHA+IL-7能明顯誘導(dǎo)健康人和結(jié)腸癌病人外周血來源的Vδ1T細胞增殖,而非Vδ2T細胞。PHA+IL-7擴增后的Vδ1T細胞高表達CD107a、 GranzymeB、FasL、TRAIL、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD57、LFA-1、 HLA-DR、CD86、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CXCR1、CXCR2、CXCR3、 CXCR5和CXCR7,而擴增后的Vδ2T細胞高表達CD56、CCR1、CCR2、CCR6、 CX3CR1、CXCR4和CXCR6.有趣的是,共抑制分子CTLA-4和PD-1在PHA+IL-7擴增后的Vδ2T細胞上高表達,而在Vδδ1T細胞上的表達較低。胞內(nèi)細胞因子檢測顯示,PHA+IL-7擴增后的Vδ1T細胞分泌大量IL-lα、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-21和GM-CSF,而Vδ2T細胞分泌較多TNF-a、IL-4和IFN-γ。和我們先前在人結(jié)腸癌組織中的研究相反,無論是擴增后的Vδ1T細胞還是Vδ2T細胞,均不分泌IL-1β、IL-17、IL-22和IL-12/23。值得注意的是,GranzymeB、Perforin、FasL、 TRAIL、NKG2D、LFA-1、NKp30、NKp44和NKp46在PHA+IL-7擴增后的Vδ1T細胞表達程度遠遠高于自然狀態(tài)。細胞毒作用實驗顯示,在同樣的效應(yīng)細胞／靶細胞比例下,健康人和結(jié)腸癌病人外周血來源的Vδδ1T細胞經(jīng)PHA+IL-7擴增后均較Vδ2T細胞能夠殺傷更多的結(jié)腸癌細胞。此外,PHA+IL-7擴增后的Vδ1T細胞的腫瘤殺傷能力較自然狀態(tài)顯著增強。 在Vδ1T細胞與結(jié)腸癌細胞及其克隆球細胞transwell共培養(yǎng)體系中,我們發(fā)現(xiàn)Vδ1T細胞的腫瘤細胞殺傷作用明顯降低。結(jié)腸癌細胞及其克隆球細胞表面不同程度高表達Fas、DR4、DR5、MICA/B、和ICAM-1,而PHA+IL-7擴增后的Vδ1T細胞高表達FasL、TRAIL、NKG2D、NKp30和LFA-1等上述分子相應(yīng)受體或配體。細胞毒作用實驗中用FasL、TRAIL、NKG2D、NKp30和LFA-1抗體阻斷后Vδ1T細胞的腫瘤殺傷作用被顯著抑制。 3.Vδ1T細胞體系擴增及其體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)優(yōu)勢。通過細胞毒作用實驗,我們發(fā)現(xiàn)PHA+IL-7擴增的總γδT及Vδ1T細胞的腫瘤殺傷作用強于Zol+IL-2擴增的總γδ T及Vδ2T細胞和PHA+IL-2擴增的總γδT及Vδ1T細胞。我們拆分擴增體系中各種因子單獨檢測其對Vδl T細胞的增殖和存活的影響。我們發(fā)現(xiàn),PHA、PHA+IL-2、PHA+IL-2+IL-7均能高效擴增Vδ1T細胞。然而,PHA+IL-7組合更能高效擴增Vδ1T細胞而且凋亡細胞數(shù)量最少。PHA+IL-7擴增至21天,V31T細胞數(shù)量從起始的1×105擴增至1.2×107,增加100多倍,擴增效率顯著高于PHA+IL-2。與PHA+IL-2相比,PHA+IL-7更有效誘導(dǎo)Vδ1T細胞增殖并減少其凋亡,且能刺激Vδ1T細胞自分泌IL-2。此外,Vδ1T細胞增殖和存活能被IL-2和IL-7中和抗體顯著抑制。 為了驗證PHA+IL-7擴增后的V61T細胞體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng),我們用人結(jié)腸癌細胞系HT29建立了人結(jié)腸癌NOD/SCID小鼠移植瘤模型。組織HE染色顯示小鼠移植瘤和人結(jié)腸癌具有相似的組織病理學(xué)特征。我們發(fā)現(xiàn),PHA+IL-7擴增后的總γδT細胞治療組小鼠移植瘤的生長明顯受到抑制且生存時間延長,而Zol+IL-2擴增后的總,γδT細胞治療組小鼠移植瘤的生長及生存時間與對照組沒有統(tǒng)計學(xué)差異。進一步分離PHA+IL-7擴增后的Vδ1T細胞和Zol+IL-2擴增后的Vδ2T細胞治療移植瘤小鼠得到相似的結(jié)果。通過免疫熒光染色在移植瘤內(nèi)能夠清楚的看到腫瘤浸潤人CD45細胞。移植瘤小鼠外周血和脾臟流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)均有人CD45陽性細胞。 結(jié)論： 我們的研究首次證明了自然狀態(tài)下健康人和結(jié)腸癌病人外周血分離的Vδ1T細胞比Vδ2T細胞具有更強的人結(jié)腸癌細胞殺傷作用。我們建立了更優(yōu)的體系擴增健康人和結(jié)腸癌病人外周血來源的Vδ1T細胞,PHA+IL-7擴增的Vδ1T細胞有更強的結(jié)腸癌細胞及克隆球細胞殺傷作用。機制上,Vδ1T細胞通過細胞-細胞接觸依賴和細胞毒作用相關(guān)受體-配體相互作用的方式來殺傷結(jié)腸癌細胞及克隆球細胞。PHA+IL-7通過誘導(dǎo)Vδ1T細胞自分泌IL-2的方式促進其增殖和存活。最終,體內(nèi)驗證了PHA+IL-7擴增的Vδ1T細胞能明顯抑制人結(jié)腸癌移植瘤小鼠的腫瘤生長并延長小鼠生存時間�？傊�,我們的研究發(fā)現(xiàn)了更有效的Vδ1T細胞激活擴增體系,證明了人外周血Vδ1T細胞功能亞群比Vδ2T細胞具有更強的結(jié)腸癌細胞及克隆球細胞殺傷潛能,由此為人實體瘤的細胞過繼免疫治療提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周莉;呂喜英;張冠男;;PD-1在NSCLC細胞免疫治療中的研究進展[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2015年04期

2 陳清嬌;曾志勇;陳君敏;;Vγ9Vδ2T細胞免疫治療血液惡性疾病:從基礎(chǔ)到臨床[J];臨床血液學(xué)雜志;2014年02期

3 許瀟天;;腫瘤免疫治療的相關(guān)實驗室檢查[J];臨床檢驗雜志(電子版);2013年04期

4 張亞輝;朱波;趙林濤;;腫瘤5-氟尿嘧啶治療后可提高CD8~+T細胞免疫應(yīng)答[J];免疫學(xué)雜志;2014年04期

5 曹峰琦;陳，

本文編號：1728215