本文選題：人外周血Vδ1T細(xì)胞　切入點(diǎn)：人外周血Vδ2T細(xì)胞　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景： 細(xì)胞過(guò)繼免疫治療被認(rèn)為是繼手術(shù)、化療、放療之后的腫瘤重要治療手段。近年來(lái)的基礎(chǔ)和臨床研究證明,細(xì)胞過(guò)繼免疫治療能夠與傳統(tǒng)的腫瘤治療方式協(xié)同作用發(fā)揮持續(xù)的抗腫瘤效應(yīng),預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。然而,仍存在免疫細(xì)胞難以到達(dá)腫瘤局部、免疫耐受、腫瘤免疫抑制微環(huán)境等問(wèn)題限制腫瘤細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的效果。 人γδT細(xì)胞是一類進(jìn)化上保守的非MHC限制性的固有T淋巴細(xì)胞,因其TCR受體δ鏈的不同分為V61γδ6T(Vδ1T)和Vγ9Vδ2γδT(Vδ2T)兩種主要細(xì)胞亞型。生理情況下,Vδ2T細(xì)胞是人外周血γδT細(xì)胞的主要亞群,能在體外殺傷多種來(lái)源的腫瘤細(xì)胞。由于Vδ2亞群細(xì)胞數(shù)量多,體外激活擴(kuò)增方法成熟,目前基于腫瘤的γδT細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的臨床試驗(yàn)主要集中在Vδ2T細(xì)胞亞群,但其存在體內(nèi)抗腫瘤能力難以持久、對(duì)實(shí)體腫瘤的效果欠佳等不足。 人Vδ1T細(xì)胞主要分布于腸道上皮、皮膚、脾臟和肝臟,在外周血中所占比例很低。最近,Vδ1T細(xì)胞被證明能夠體外清除血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞和實(shí)體腫瘤尤其是上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞,也能在體外培養(yǎng)擴(kuò)增。激活的Vδ1T細(xì)胞能在血循環(huán)中持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),有望成為腫瘤的細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的候選細(xì)胞亞群。然而人外周血Vδ1和Vδ2T細(xì)胞的腫瘤殺傷作用哪個(gè)更強(qiáng)、能否殺傷腫瘤干細(xì)胞以及如何體外激活擴(kuò)增獲得大量高純度Vδ1T細(xì)胞等尚不清楚。我們?cè)噲D以結(jié)腸癌為例研究γδT細(xì)胞在腫瘤過(guò)繼免疫治療中的作用及機(jī)制。 研究方法： 為了明確自然狀態(tài)下人外周血γδT細(xì)胞的特征及腫瘤殺傷作用,我們首先通過(guò)原代外周血淋巴細(xì)胞分離及流式細(xì)胞檢測(cè)分析健康人外周血中Vδ1和Vδ2T細(xì)胞分別占總γδT細(xì)胞的比例、CD69的表達(dá)水平、細(xì)胞表型、細(xì)胞因子分泌及趨化因子受體表達(dá)等；然后通過(guò)結(jié)腸癌細(xì)胞低血清培養(yǎng)技術(shù)獲得干細(xì)胞樣克隆球細(xì)胞并對(duì)其干細(xì)胞特性包括克隆球形態(tài)、干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)、成瘤能力等進(jìn)行鑒定;最后通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)分離V61和Vδ2T細(xì)胞亞群,分別與結(jié)腸癌細(xì)胞及其克隆球細(xì)胞短期共培養(yǎng),流式細(xì)胞檢測(cè)比較結(jié)腸癌細(xì)胞及其克隆球細(xì)胞凋亡情況。 為了研究Vδ1T細(xì)胞體外擴(kuò)增方法及其殺傷腫瘤的機(jī)制,我們首先磁珠分選出人外周血總γδT細(xì)胞,通過(guò)PHA+IL-7體外短期培養(yǎng)擴(kuò)增14天,流式細(xì)胞檢測(cè)分析Vδ1T細(xì)胞體外培養(yǎng)前后在總γδT細(xì)胞中所占的比例并用CFSE法分析其增殖水平；然后用流式細(xì)胞檢測(cè)分析擴(kuò)增后Vδ1和Vδ2T細(xì)胞表型、細(xì)胞因子分泌、趨化因子受體表達(dá)情況；同時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)分離Vδ1和V62T細(xì)胞亞群分別與結(jié)腸癌細(xì)胞及其克隆球細(xì)胞短期共培養(yǎng),流式細(xì)胞檢測(cè)比較結(jié)腸癌細(xì)胞及其克隆球細(xì)胞凋亡情況；為了明確Vδ1T細(xì)胞的腫瘤殺傷機(jī)制,我們通過(guò)transwell共培養(yǎng)的方法分析Vδ1T細(xì)胞體外殺傷腫瘤細(xì)胞的方式；然后通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)分析Vδ1T細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞表面細(xì)胞毒作用相關(guān)分子受體及配體表達(dá)情況；最后通過(guò)細(xì)胞毒作用相關(guān)分子阻斷抗體驗(yàn)證Vδ1T細(xì)胞體外殺傷腫瘤的途徑。 為了闡明Vδ1T細(xì)胞體系擴(kuò)增及其體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)優(yōu)勢(shì),首先我們將PHA+IL-7擴(kuò)增的總γδT和V61T細(xì)胞與傳統(tǒng)Zol+IL-2方法擴(kuò)增后的總yδT和V62T細(xì)胞、PHA+IL-2擴(kuò)增的總γδT和Vδ1T細(xì)胞的體外殺傷腫瘤效應(yīng)進(jìn)行比較；為了解釋PHA+IL-7促進(jìn)Vδ1T細(xì)胞增殖和存活的優(yōu)勢(shì),我們比較了PHA+IL-7和PHA+IL-2兩種擴(kuò)增方法中V61T細(xì)胞的增殖及存活情況；然后通過(guò)ELISA方法檢測(cè)了兩種擴(kuò)增體系中IL-2的分泌量；接著通過(guò)IL-2和IL-7中和抗體分析其對(duì)Vδ1T細(xì)胞增殖和凋亡的影響。最后通過(guò)建立人結(jié)腸癌NOD/SCID小鼠移植瘤模型驗(yàn)證Vδ1T細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。 研究結(jié)果： 1.人新鮮外周血yδT細(xì)胞亞群的特征及腫瘤(干)細(xì)胞殺傷作用。自然狀態(tài)下健康人外周血γδT細(xì)胞以Vδ2T細(xì)胞亞群為主,Vδ1T細(xì)胞比例僅占1%-10%。人新鮮外周血Vδ1亞群表面細(xì)胞活性標(biāo)記CD69的表達(dá)高于Vδ2亞群。此外,Vδ1T細(xì)胞高表達(dá)CD107a、Perforin、GranzymeB、TRAIL、CD57和HLA-DR,而Vδ2T細(xì)胞高表達(dá)DNAM-1、CD56、TNF-a和IFN-γ。與Vδ2T細(xì)胞比較,Vδ1T細(xì)胞還高表達(dá)CCR4、CCR6、CCR7、CXCR1、CXCR5和CXCR7。其他細(xì)胞表面標(biāo)記和細(xì)胞因子分泌未見(jiàn)明顯差異。 新鮮外周血Vδ1和Vδ2T細(xì)胞流式分選純度大于90%。低血清條件下培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞14天后細(xì)胞顯示干細(xì)胞相關(guān)特性,如具有克隆球形態(tài),高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因,小鼠體內(nèi)成瘤能力增強(qiáng)。細(xì)胞毒作用實(shí)驗(yàn)顯示,在同樣的效應(yīng)細(xì)胞／靶細(xì)胞比例下,健康人外周血Vδ1T細(xì)胞較同一樣本配對(duì)的Vδ2T細(xì)胞能夠殺傷更多的結(jié)腸癌細(xì)胞及相應(yīng)克隆球細(xì)胞。同樣地,結(jié)腸癌病人外周血Vδ1T細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞也具有較Vδ2T細(xì)胞更強(qiáng)的殺傷作用。 2.Vδ1T細(xì)胞體外擴(kuò)增體系的構(gòu)建及其殺傷腫瘤的機(jī)制。 磁珠分選γδT細(xì)胞純度大于90%,經(jīng)體外PHA+IL-7培養(yǎng)14天后,Vδ1T細(xì)胞被選擇性富集擴(kuò)增,在γδT細(xì)胞中所占比例從約10%提高到80%左右,而Vδ2T細(xì)胞比例顯著下降。PHA+IL-7能明顯誘導(dǎo)健康人和結(jié)腸癌病人外周血來(lái)源的Vδ1T細(xì)胞增殖,而非Vδ2T細(xì)胞。PHA+IL-7擴(kuò)增后的Vδ1T細(xì)胞高表達(dá)CD107a、 GranzymeB、FasL、TRAIL、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD57、LFA-1、 HLA-DR、CD86、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CXCR1、CXCR2、CXCR3、 CXCR5和CXCR7,而擴(kuò)增后的Vδ2T細(xì)胞高表達(dá)CD56、CCR1、CCR2、CCR6、 CX3CR1、CXCR4和CXCR6.有趣的是,共抑制分子CTLA-4和PD-1在PHA+IL-7擴(kuò)增后的Vδ2T細(xì)胞上高表達(dá),而在Vδδ1T細(xì)胞上的表達(dá)較低。胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)顯示,PHA+IL-7擴(kuò)增后的Vδ1T細(xì)胞分泌大量IL-lα、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-21和GM-CSF,而Vδ2T細(xì)胞分泌較多TNF-a、IL-4和IFN-γ。和我們先前在人結(jié)腸癌組織中的研究相反,無(wú)論是擴(kuò)增后的Vδ1T細(xì)胞還是Vδ2T細(xì)胞,均不分泌IL-1β、IL-17、IL-22和IL-12/23。值得注意的是,GranzymeB、Perforin、FasL、 TRAIL、NKG2D、LFA-1、NKp30、NKp44和NKp46在PHA+IL-7擴(kuò)增后的Vδ1T細(xì)胞表達(dá)程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然狀態(tài)。細(xì)胞毒作用實(shí)驗(yàn)顯示,在同樣的效應(yīng)細(xì)胞／靶細(xì)胞比例下,健康人和結(jié)腸癌病人外周血來(lái)源的Vδδ1T細(xì)胞經(jīng)PHA+IL-7擴(kuò)增后均較Vδ2T細(xì)胞能夠殺傷更多的結(jié)腸癌細(xì)胞。此外,PHA+IL-7擴(kuò)增后的Vδ1T細(xì)胞的腫瘤殺傷能力較自然狀態(tài)顯著增強(qiáng)。 在Vδ1T細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞及其克隆球細(xì)胞transwell共培養(yǎng)體系中,我們發(fā)現(xiàn)Vδ1T細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷作用明顯降低。結(jié)腸癌細(xì)胞及其克隆球細(xì)胞表面不同程度高表達(dá)Fas、DR4、DR5、MICA/B、和ICAM-1,而PHA+IL-7擴(kuò)增后的Vδ1T細(xì)胞高表達(dá)FasL、TRAIL、NKG2D、NKp30和LFA-1等上述分子相應(yīng)受體或配體。細(xì)胞毒作用實(shí)驗(yàn)中用FasL、TRAIL、NKG2D、NKp30和LFA-1抗體阻斷后Vδ1T細(xì)胞的腫瘤殺傷作用被顯著抑制。 3.Vδ1T細(xì)胞體系擴(kuò)增及其體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)優(yōu)勢(shì)。通過(guò)細(xì)胞毒作用實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)PHA+IL-7擴(kuò)增的總γδT及Vδ1T細(xì)胞的腫瘤殺傷作用強(qiáng)于Zol+IL-2擴(kuò)增的總γδ T及Vδ2T細(xì)胞和PHA+IL-2擴(kuò)增的總γδT及Vδ1T細(xì)胞。我們拆分?jǐn)U增體系中各種因子單獨(dú)檢測(cè)其對(duì)Vδl T細(xì)胞的增殖和存活的影響。我們發(fā)現(xiàn),PHA、PHA+IL-2、PHA+IL-2+IL-7均能高效擴(kuò)增Vδ1T細(xì)胞。然而,PHA+IL-7組合更能高效擴(kuò)增Vδ1T細(xì)胞而且凋亡細(xì)胞數(shù)量最少。PHA+IL-7擴(kuò)增至21天,V31T細(xì)胞數(shù)量從起始的1×105擴(kuò)增至1.2×107,增加100多倍,擴(kuò)增效率顯著高于PHA+IL-2。與PHA+IL-2相比,PHA+IL-7更有效誘導(dǎo)Vδ1T細(xì)胞增殖并減少其凋亡,且能刺激Vδ1T細(xì)胞自分泌IL-2。此外,Vδ1T細(xì)胞增殖和存活能被IL-2和IL-7中和抗體顯著抑制。 為了驗(yàn)證PHA+IL-7擴(kuò)增后的V61T細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng),我們用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29建立了人結(jié)腸癌NOD/SCID小鼠移植瘤模型。組織HE染色顯示小鼠移植瘤和人結(jié)腸癌具有相似的組織病理學(xué)特征。我們發(fā)現(xiàn),PHA+IL-7擴(kuò)增后的總γδT細(xì)胞治療組小鼠移植瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制且生存時(shí)間延長(zhǎng),而Zol+IL-2擴(kuò)增后的總,γδT細(xì)胞治療組小鼠移植瘤的生長(zhǎng)及生存時(shí)間與對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步分離PHA+IL-7擴(kuò)增后的Vδ1T細(xì)胞和Zol+IL-2擴(kuò)增后的Vδ2T細(xì)胞治療移植瘤小鼠得到相似的結(jié)果。通過(guò)免疫熒光染色在移植瘤內(nèi)能夠清楚的看到腫瘤浸潤(rùn)人CD45細(xì)胞。移植瘤小鼠外周血和脾臟流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)均有人CD45陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論： 我們的研究首次證明了自然狀態(tài)下健康人和結(jié)腸癌病人外周血分離的Vδ1T細(xì)胞比Vδ2T細(xì)胞具有更強(qiáng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷作用。我們建立了更優(yōu)的體系擴(kuò)增健康人和結(jié)腸癌病人外周血來(lái)源的Vδ1T細(xì)胞,PHA+IL-7擴(kuò)增的Vδ1T細(xì)胞有更強(qiáng)的結(jié)腸癌細(xì)胞及克隆球細(xì)胞殺傷作用。機(jī)制上,Vδ1T細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴和細(xì)胞毒作用相關(guān)受體-配體相互作用的方式來(lái)殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞及克隆球細(xì)胞。PHA+IL-7通過(guò)誘導(dǎo)Vδ1T細(xì)胞自分泌IL-2的方式促進(jìn)其增殖和存活。最終,體內(nèi)驗(yàn)證了PHA+IL-7擴(kuò)增的Vδ1T細(xì)胞能明顯抑制人結(jié)腸癌移植瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間�？傊�,我們的研究發(fā)現(xiàn)了更有效的Vδ1T細(xì)胞激活擴(kuò)增體系,證明了人外周血Vδ1T細(xì)胞功能亞群比Vδ2T細(xì)胞具有更強(qiáng)的結(jié)腸癌細(xì)胞及克隆球細(xì)胞殺傷潛能,由此為人實(shí)體瘤的細(xì)胞過(guò)繼免疫治療提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1728215