本文選題：miR-128　切入點(diǎn)：ZEB1　出處：《武漢大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：PCa是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,大多數(shù)PCa病人治療失敗和最終死亡的主要原因是由于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受并出現(xiàn)局部侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。盡管新研發(fā)的藥物使得對(duì)PCa的控制取得了一些進(jìn)步,但研究其化療耐藥和侵襲的機(jī)制、尋找有用的治療靶點(diǎn)、開發(fā)新的治療方法、改善目前的治療現(xiàn)狀以及延長(zhǎng)病人的生存時(shí)間仍然是當(dāng)務(wù)之急。miRNA是一組內(nèi)源性、小的、非編碼、單鏈RNA,它可通過(guò)與靶基因mRNA的3’-UTR序列相結(jié)合,最終導(dǎo)致靶基因mRNA的翻譯受到抑制或徹底降解,因而能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)�，F(xiàn)有證據(jù)表明,作為癌基因或腫瘤抑制因子,miRNA在多種癌中異常表達(dá)。許多報(bào)道表明,一些miRNA在PCa化療耐藥和侵襲中起重要作用。本研究選取miR-128,通過(guò)生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè)其可能的靶基因及其結(jié)合位點(diǎn),探討miR-128對(duì)PCa化療敏感性和侵襲性的影響及其可能的機(jī)制。第一部分：miR-128在前列腺癌中表達(dá)及功能的研究目的 檢測(cè)miR-128在PCa和正常前列腺組織中的表達(dá)情況,探討miR-128對(duì)PCa細(xì)胞化療敏感性和侵襲性的影響。方法收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院8例PCa和正常前列腺組織,所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí),real-time RT-PCR分別檢測(cè)PCa組織和正常前列腺組織中miR-128的表達(dá)情況。將miR-128 mimic和Scramble分別轉(zhuǎn)染PCa細(xì)胞系DU-145和LNCaP, real time RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-128的表達(dá)水平。將轉(zhuǎn)染成功的PCa細(xì)胞系分別加入不同濃度梯度的順鉑(cDDP),采用MTS法檢測(cè)癌細(xì)胞存活情況,采用Transwell法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的PCa細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果real-time RT-PCR檢測(cè)PCa和正常前列腺組織中miR-128的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)PCa組織中miR-128的表達(dá)水平較正常前列腺組織低,其差異有顯著性。miR-128 mimic使得DU-145和LNCaP細(xì)胞系中miR-128的表達(dá)量分別上調(diào)15.93倍和13.07倍,其差異具有顯著性。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組PCa細(xì)胞的存活率下降,發(fā)生侵襲的PCa細(xì)胞數(shù)量減少。結(jié)論miR-128在PCa組織中表達(dá)下調(diào),并能增加PCa細(xì)胞對(duì)cDDP的化療敏感性,抑制其侵襲性。第二部分：前列腺癌中miRNA-128靶基因的研究目的 預(yù)測(cè)miRNA-128的靶基因,從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)靶基因在PCa和癌旁正常前列腺組織中的表達(dá)情況,探討其對(duì)PCa細(xì)胞化療敏感性和侵襲性的影響。方法通過(guò)miRNA公共數(shù)據(jù)庫(kù)查詢miR-128可能的靶點(diǎn),篩查具有保守結(jié)合位點(diǎn)的基因,結(jié)合文獻(xiàn)檢索最終確定研究對(duì)象。real time RT-PCR和western blot分別檢測(cè)PCa和癌旁正常前列腺組織中ZEB1的表達(dá)水平。分別構(gòu)建pMir-ZEB1-wt和pMir-ZEB1-mut表達(dá)載體,將pMir-ZEB 1-wt/mut與miR-128 mimic/Scramble分別共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性變化。針對(duì)ZEB1的不同區(qū)域設(shè)計(jì)三種不同的siRNA,分別轉(zhuǎn)染入DU-145細(xì)胞系,western blot檢測(cè)RNAi效率,挑選沉默效果最好的siRNA-ZEB1作為后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)組。將陰性對(duì)照、沉默效果最好和最差的siRNA-ZEB1分別轉(zhuǎn)染DU-145和LNCaP細(xì)胞系,加入不同濃度的cDDP, MTS法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞的存活情況,Transwell檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的PCa細(xì)胞的侵襲性變化。結(jié)果綜合miRNA公共數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)檢索的結(jié)果,最終確定ZEB1為進(jìn)一步研究的靶點(diǎn)。與正常組織相比,real time RT-PCR和western blot檢測(cè)癌組織中ZEB1的mRNA口蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均升高,其差異具有顯著性。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了pMir-ZEB1-wt的HEK-293T細(xì)胞系中,熒光素酶的活性明顯降低,而轉(zhuǎn)染了突變型pMir-ZEB1-mut的細(xì)胞系則沒(méi)有這樣的變化,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。western blot篩選出siRNA-ZEB1-#1的沉默效率最高,用作實(shí)驗(yàn)組,siRNA-ZEB1-#2沉默效果最差,用作對(duì)照組,分別轉(zhuǎn)染PCa細(xì)胞系,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組PCa細(xì)胞存活率下降,發(fā)生侵襲的PCa細(xì)胞數(shù)量減少。結(jié)論miR-128直接靶向調(diào)控ZEB1, ZEB1在PCa組織中表達(dá)上調(diào),并能降低PCa細(xì)胞對(duì)化療的敏感性,提高其侵襲性。第三部分：前列腺癌中miR-128靶向調(diào)控ZEB1機(jī)制的研究目的探索PCa中miR-128與ZEB1的靶向調(diào)控機(jī)制方法將DU-145和LNCaP分別轉(zhuǎn)染miR-128 mimic和Scramble后,real time RT-PCR和western blot分別檢測(cè)ZEB1的表達(dá)水平。進(jìn)一步構(gòu)建pLEX-ZEB1-ORF表達(dá)載體,以pLEX-MCS作為對(duì)照,分別將它們和miR-128 mimic共轉(zhuǎn)染DU-145和LNCaP細(xì)胞,real time RT-PCR和western blot分別檢測(cè)PCa細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)情況。在共轉(zhuǎn)染PCa細(xì)胞中分別加入不同濃度的cDDP, MTS法檢測(cè)癌細(xì)胞存活情況,Transwell檢測(cè)PCa細(xì)胞侵襲性變化。結(jié)果DU-145和LNCaP分別轉(zhuǎn)染miR-128 mimic和scramble后,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ZEB1的mRNA的表達(dá)分別下降74%和63%,其差異具有顯著性,ZEB1蛋白質(zhì)表達(dá)水平也明顯下調(diào)。與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染了pLEX-ZEB1-ORF的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ZEB1的mRNA表達(dá)量分別上升3.87倍和4.81倍,其差異具有顯著性,ZEB1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平也明顯上升。MTS檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染miR-128 mimic后,實(shí)驗(yàn)組PCa細(xì)胞的存活率反而升高,發(fā)生侵襲的PCa細(xì)胞數(shù)量增加。結(jié)論miR-128可抑制PCa細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)水平,共轉(zhuǎn)染miR-128 mimic和pLEX-ZEB1-ORF后,PCa細(xì)胞中ZEB1表達(dá)水平升高,pLEX-ZEB1-ORF可逆轉(zhuǎn)miR-128對(duì)PCa細(xì)胞的化療敏感性和侵襲性效應(yīng)。
[Abstract]:The expression of miR - 128 in PCa and normal prostate tissues was investigated by means of bioinformatics . The results of the expression of miR - 128 in PCa cell line transfected with different concentrations of cDDP and MTS were used as control groups to detect the survival of PCa cells in PCa cells . Conclusion miR - 128 can inhibit the expression level of zeB1 in PCa cells and increase the number of PCa cells in PCa cells . Conclusion miR - 128 can inhibit the expression level , pLEX - ZB1 - ORF , and reverse the chemosensitivity and invasive effect of miR - 128 on PCa cells .

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.25

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