本文選題：多發(fā)性骨髓瘤　切入點：耐藥株　出處：《青島大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:多發(fā)性骨髓瘤是一種惡性血液腫瘤近幾年其發(fā)病率逐漸增高,而隨著疾病的進展給患者帶來極大的痛苦,當前治療方法有限。由于化療藥的聯(lián)合應用,極易產(chǎn)生多發(fā)耐藥。多發(fā)耐藥一旦產(chǎn)生,患者大多預后不良。因此,我們不斷尋求新的治療方法,細胞免疫療法CAR-T技術(shù)其實就是將目的基因植入病毒載體內(nèi)然后將病毒轉(zhuǎn)入患者的T細胞使其表達特定的抗體。在前期研究中發(fā)現(xiàn)單鏈可變片斷(SCFV)取代了細胞外的抗原結(jié)合域使得TCR發(fā)生了改變,這樣就使CAR-T具有MHC非限制性識別的優(yōu)點,讓其更好地發(fā)揮識別和抗腫瘤細胞的作用。特別是一些研究發(fā)現(xiàn)CD19-CAR-T在CD19陽性B細胞惡性腫瘤上取得了很好的效果。而CD138是一個表面蛋白,它的作用是當作粘附分子結(jié)合細胞外基質(zhì)分子的膠原蛋白和纖維連接蛋白。CD138在骨髓瘤細胞表面高表達,但是幾乎不表達于其他的造血細胞,包括T細胞和B細胞。因此,CD138成為了一個用CAR-T療法治療多發(fā)性骨髓瘤很好的靶點�；谝陨显O(shè)計了本實驗。我們研究的主要目的是探討細胞免疫療法CD138-CAR-T對于多發(fā)性骨髓瘤細胞普通株RPMI8226的殺傷作用,以及對耐藥株MM1R的殺傷作用。評估CD138分子作為細胞療法CAR-T靶點的效果。方法:構(gòu)建攜帶有CD138抗體的慢病毒以及未攜帶目的基因的慢病毒,然后分離提取人的T淋巴細胞,將慢病毒轉(zhuǎn)入T淋巴細胞構(gòu)建成CD138-CAR-T和攜帶空病毒的T細胞。然后用流式細胞術(shù)檢測CD138-CAR-T的轉(zhuǎn)染效率,檢測多發(fā)性骨髓瘤普通株RPMI8226、耐藥株MM1R及陰性對照細胞293T細胞表面CD138分子的表達水平,流式細胞術(shù)檢測CD138-CAR-T和攜帶空病毒的T細胞在效靶比為10:1和1:1時分別對多發(fā)性骨髓瘤普通株RPMI8226,耐藥株MM1R以及CD138陰性對照細胞株293T細胞的殺傷作用。結(jié)果:CD138-CAR轉(zhuǎn)染至T細胞的效率為46.25%,RPMI8226細胞表面CD138表達量較高而MM1R細胞表面表達量較低,因此為探究CAR-T細胞對于多發(fā)性骨髓瘤耐藥株CD138高表達與低表達的作用我們又將MM1R CD138陽性細胞分選出來培養(yǎng)提高其陽性率。293T細胞表面CD138基本不表達。對于RPMI8226和分選后的MM1R來說,CD138-CAR-T組比攜帶空病毒的T細胞組殺傷作用強。而對于分選前的MM1R及293T細胞來說,CD138-CAR-T組與攜帶空病毒的T細胞組殺傷作用無明顯差別。同時分選后的MM1R細胞組CD138-CAR-T殺傷作用顯著強于未分選MM1R細胞組。并且在效靶比為10:1時殺傷作用要好于效靶比1:1時。對于293T細胞組來說CD138-CAR-T組與對照T細胞組無顯著統(tǒng)計學差異。結(jié)論:CD138-CAR-T對于腫瘤細胞表面CD138陽性的多發(fā)性骨髓瘤普通株RPMI8226和耐藥株MM1R均有顯著的殺傷作用,而對于CD138陰性細胞株293T則沒有顯著的殺傷作用,因此不論耐藥株還是普通株其殺傷作用的好壞依賴于細胞表面CD138分泌水平的高低,分泌水平高殺傷作用好。
[Abstract]:Objective: multiple myeloma is a malignant hematologic tumor whose incidence has been increasing in recent years, but with the progress of the disease to bring great pain to patients, the current treatment is limited.Because of the combination of chemotherapeutic agents, it is easy to produce multiple drug resistance.Multiple drug resistance, once produced, the majority of patients with poor prognosis.Therefore, we are constantly looking for new treatment methods. Cellular immunotherapy (CAR-T) technology is to insert the target gene into the virus vector and then transfer the virus into the T cells of patients to express specific antibodies.In previous studies, it was found that SCFV) replaced the extracellular antigen-binding domain (TCR), which made CAR-T have the advantage of MHC non-restrictive recognition and make it play a better role in recognition and anti-tumor cells.In particular, some studies have found that CD19-CAR-T has a good effect on CD19-positive B-cell malignant tumors.CD138 is a surface protein that acts as an adhesion molecule to collagen and fibronectin. CD138, which binds to extracellular matrix molecules, is highly expressed on the surface of myeloma cells, but hardly expressed in other hematopoietic cells.Including T cells and B cells.CD138 has therefore become a good target for CAR-T therapy in the treatment of multiple myeloma.Based on the above, the experiment is designed.The main purpose of our study was to investigate the cytotoxicity of cellular immunotherapy (CD138-CAR-T) on the RPMI8226 of multiple myeloma cell line and the killing effect on the drug-resistant cell line MM1R.To evaluate the effect of CD138 molecule as a target of CAR-T for cell therapy.Methods: lentivirus carrying CD138 antibody and lentivirus without target gene were constructed. Human T lymphocytes were isolated and transformed into CD138-CAR-T and empty T cells.Then flow cytometry was used to detect the transfection efficiency of CD138-CAR-T, the expression of CD138 molecules on the surface of multiple myeloma cell line RPMI8226, drug-resistant cell line MM1R and negative control cell line 293T.Flow cytometry was used to detect the killing effect of CD138-CAR-T and T cells carrying empty virus on RPMI8226, MM1R and 293T cells at 10:1 and 1:1, respectively.Results the efficiency of CD138 transfection to T cells was 46.25% and that of RPMI8226 cells was higher than that of MM1R cells.Therefore, in order to investigate the effect of CAR-T cells on the high and low expression of CD138 in multiple myeloma resistant cell lines, we isolated and cultured MM1R CD138 positive cells to increase the positive rate of CD138 on the surface of the cell line .293T.The cytotoxicity of CD138-CAR-T group was stronger than that of empty-carrying T cell group for RPMI8226 and MM1R.However, there was no significant difference between CD138-CAR-T group and empty virus carrying T cell group for MM1R and 293T cells before sorting.At the same time, the cytotoxicity of CD138-CAR-T in MM1R cells group was significantly stronger than that in MM1R cell group.The killing effect is better at 10:1 than at 1:1.There was no significant difference between CD138-CAR-T group and control T cell group for 293 T cell group.Conclusion the cell surface CD138 positive CD138 positive multiple myeloma strain RPMI8226 and drug-resistant cell line MM1R have significant killing effect on the tumor cell line: CD138-CAR-T, but not on the CD138 negative cell line 293T, but not on the CD138 negative cell line 293T, but not on the CD138 negative cell line 293T, but not on the CD138 negative cell line 293T.Therefore, the cytotoxicity of drug resistant strain and common strain depends on the level of CD138 secretion on the cell surface, and the high level of secretion is good.
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.3

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本文編號：1714867