本文選題：肝細胞肝癌　切入點：COX-2抑制劑　出處：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：目的:肝細胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是一種常見的嚴重威脅人類健康且惡性程度極高的消化道腫瘤。在世界范圍內,HCC的發(fā)病率居第6位,而致死率則居第2位。目前,僅有20%的HCC患者能夠接受有效的治療,針對中晚期HCC患者的有效治療手段仍然很少。索拉非尼是目前唯一被證實可改善進展期HCC患者生存情況的靶向藥物,但是與安慰劑相比較,索拉非尼僅僅能延長晚期HCC患者2-3個月的中位生存期。由此可見,深入探尋HCC惡性增殖以及凋亡抵抗的分子機制,尋找新策略和方法來改變目前HCC的治療現(xiàn)狀具有十分重要的意義。越來越多的證據(jù)顯示環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡抵抗。美洛昔康(Meloxicam)作為選擇性的COX-2抑制劑和非甾體類抗炎藥(NSAlD)已經(jīng)被廣泛的應用于炎癥的治療。此外,Meloxicam能夠通過降低COX-2的表達抑制腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞的凋亡。但是,Meloxicam殺傷HCC的具體機制至今仍不不明了。HCC在其發(fā)生發(fā)展過程中要不斷應對各種理化因素的刺激,肝癌細胞在應對機體這種微環(huán)境的改變時必然會產(chǎn)生一系列反應來改變其生物學行為或功能,而內質網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)就是HCC常見的一種應激性反應。內質網(wǎng)應激與細胞內多種信號傳導通路之間具有相互作用,因此,有必要闡明肝癌細胞在內質網(wǎng)應激狀態(tài)下增殖活性和凋亡抵抗能力的變化。自噬是細胞高度保守的過程,它通過形成自噬體將物質轉運至溶酶體進行降解,是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制。之前的研究結果顯示一些抗腫瘤治療能夠導致腫瘤細胞的自噬和凋亡,靶向作用于自噬能夠增強腫瘤化療的敏感性。基于此,我們設計了本實驗來探討靶向作用于細胞自噬是否能夠通過上調內質網(wǎng)應激性凋亡增強Meloxicam對肝癌細胞的殺傷力。方法:首先選取5種最為常見的人肝癌細胞系-HepG2、Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721 和 SMMC-7402,應用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測這 5種肝癌細胞的細胞活力,篩選出其中對Meloxicam治療最為敏感的兩種細胞株(HepG2和Bel-7402)進行下一步實驗。應用流式細胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測HepG2和Bel-7402兩種肝癌細胞經(jīng)不同濃度Meloxicam處理后細胞凋亡率的變化。采用Western blot檢測內質網(wǎng)應激相關蛋白IRE1,GRP78/Bip以及磷酸化eIF2α的表達。同時,應用免疫熒光實驗(Immunofluorescence Assay)進一步檢測GRP78的定位表達情況。應用Western blot檢測經(jīng)不同濃度Meloxicam處理后,HepG2和Bel-7402細胞中內質網(wǎng)凋亡特異性蛋白Caspase-12以及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3和PARP蛋白的表達。通過RT-PCR檢測Meloxicam對Caspase-12 mRNA表達的影響。另外,應用細胞凋亡抑制劑(Z-VAD-FMK,Z-VAD)進一步探討Meloxicam誘導HepG2和Bel-7402細胞凋亡的分子機制。實驗中應用小干擾RNA(siRNA)特異性沉默GRP78,然后應用CCK-8檢測經(jīng)Meloxicam處理后,HepG2和Bel-7402的細胞活力;應用Western blot檢測GRP78蛋白的表達情況;應用流式細胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡率的變化。(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是 GRP78 的抑制劑,應用 Annexin V/PI 雙染法和 Western blot 檢測 EGCG 對 Meloxicam 誘導 HepG2和Bel-7402細胞凋亡的影響。應用Western blot檢測自噬激活的標志性蛋白Beclin-1,Atg5,Atg7,LC3和p62的表達。然后應用免疫熒光染色檢測經(jīng)Meloxicam處理后,HepG2和Bel-7402細胞LC3的變化。為了進一步探討自噬是否在Meloxicam介導的HepG2和Bel-7402細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用,我們應用細胞自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和Atg5 siRNA特異性沉默Atg5來抑制Meloxicam誘導的HepG2和Bel-7402細胞自噬的激活。分別應用流式細胞儀Annexin V/PI雙染法和Western blot檢測HepG2和Bel-7402細胞的凋亡率以及自噬和內質網(wǎng)應激性凋亡相關蛋白LC3、Atg5和Caspase-12的表達情況。為了進一步研究GRP78蛋白是否參與了 Meloxicam誘導HepG2和Bel-7402細胞自噬的激活,分別應用GRP78 siRNA和EGCG抑制GRP78蛋白的表達,應用Western blot檢測HepG2和Bel-7402細胞白噬標志蛋白LC3的表達。為了明確AMPK-mTOR信號通路在Meloxicam處理的HepG2和Bel-7402細胞中是否參與了 GRP78蛋白調控的細胞自噬,分別應用GRP78 siRNA和EGCG抑制GRP78蛋白的表達,應用Western blot檢測HepG2和Bel-7402細胞AMPK和mTOR的表達。為了進一步研究這其中的分子機制,分別應用AMPK特異性抑制劑compound C和mTOR特異性抑制劑Rapamycin抑制AMPK和mTOR的表達,應用Western blot檢測HepG2和Bel-7402細胞LC3的表達。結果:CCK-8實驗顯示經(jīng)不同濃度Meloxicam處理后,這五種肝癌細胞的細胞活力與對照組相比均有明顯的下降,并且在Meloxicam濃度為80μM時,對細胞活力的抑制率達到峰值。由于HepG2和Bel-7402兩種肝癌細胞對Meloxicam的敏感性較其它肝癌細胞高,因此,選擇這兩種細胞進行下一步實驗。流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示Meloxicam能夠誘導HepG2和Bel-7402細胞凋亡,并且呈現(xiàn)出濃度依賴性。進一步研究其分子機制,Western blot蛋白檢測結果顯示經(jīng)Meloxicam處理后,HepG2和Bel-7402細胞內質網(wǎng)應激標志性蛋白IRE1、GRP78/Bip以及磷酸化的eIF2αα明顯增高且呈現(xiàn)出濃度依賴性。免疫熒光染色的方法觀察GRP78的定位表達,結果顯示與對照組相比,Meloxicam能夠明顯增強GRP78的定位表達。Caspase-12的表達與內質網(wǎng)應激性凋亡相關,本實驗中,Western blot蛋白檢測結果顯示Meloxicam激活了 Caspase-12的表達,這與細胞凋亡的分析結果是一致的。同時通過Western blot蛋白檢測我們也觀察到凋亡執(zhí)行蛋白Casapse-3和PARP的表達也隨著Meloxciam濃度的增加而上調。RT-PCR結果顯示Meloxicam同樣能夠增強Caspase-12 mRNA的表達。另外,我們應用凋亡抑制劑Z-VAD來分析Meloxciam對HepG2和Bel-7402細胞凋亡的影響。流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示Z-VAD明顯降低了Meloxicam誘導肝癌細胞凋亡的作用。說明Meloxicam導致的內質網(wǎng)應激能夠觸發(fā)HepG2和Bel-7402細胞的凋亡,同時Caspases蛋白參與了這一過程。應用GRP78 siRNA特異性沉默HepG2和Bel-7402細胞中GRP78的表達。CCK-8細胞活力檢測發(fā)現(xiàn)抑制GRP78明顯降低了肝癌細胞的細胞活力。Western blot蛋白檢測結果顯示與對照組相比,GRP78 siRNA明顯降低了肝癌細胞GRP78的表達,同時流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡結果顯示抑制GRP78的表達能夠明顯增強Meloxicam誘導肝癌細胞凋亡的能力。接下來,我們應用GRP78特異性的抑制劑EGCG繼續(xù)探討Meloxicam誘導肝癌細胞凋亡的分子機制。Western blot蛋白檢測結果顯示與對照組相比,EGCG明顯下調了 HepG2和Bel-7402細胞中GRP78的表達,流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡結果顯示聯(lián)合EGCG能夠顯著增強Meloxicam誘導肝癌細胞凋亡的能力。通過Western blot蛋白檢測,我們發(fā)現(xiàn)Meloxicam顯著增強了自噬標志性蛋白Beclin-1,、Atg5、Atg7 和 LC3 的表達,相反,Meloxicam 下調了 HepG2 和 Bel-7402細胞中p62蛋白的表達。為了進一步證實Western blot的檢測結果,我們對LC3進行免疫熒光染色,結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,Meloxicam明顯增強了肝癌細胞中LC3的定位表達。接下來,我們探討自噬在Meloxicam誘導肝癌細胞內質網(wǎng)應激性凋亡中起到何種作用。我們應用細胞自噬特異性的抑制劑3-MA抑制HepG2和Bel-7402細胞的自噬。流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示3-MA明顯增強了 Meloxicam誘導肝癌細胞凋亡的能力,而3-MA單獨用藥并不能明顯導致肝癌細胞的凋亡。Western blot蛋白檢測結果顯示3-MA降低了 LC3的表達,相反,上調了 Caspase-12的表達。接下來,我們應用Atg5siRNA特異性干擾Atg5的表達抑制自噬,同樣通過流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡以及Western blot蛋白檢測結果顯示抑制Atg5的表達顯著增強了Meloxicam介導的肝癌細胞內質網(wǎng)應激性的細胞凋亡。通過Western blot實驗我們發(fā)現(xiàn)抑制GRP78蛋白的表達能夠下調HepG2和Bel-7402細胞LC3的表達。表明下調GRP78蛋白的表達能夠抑制Meloxicam誘導的肝癌細胞自噬的激活。AMPK-mTOR信號通路在細胞自噬的調控中起到重要的作用。因此,我們探討該信號通路是否參與了 GRP78調控肝癌細胞自噬的激活。Western blot蛋白檢測結果顯示Meloxicam激活了 AMPK但是抑制了 mTOR的磷酸化。相反,應用GRP78 siRNA或者EGCG則抑制了 AMPK,而增強了 mTOR的磷酸化。為了進一步研究AMPK-mTOR信號通路在Meloxicam誘導肝癌細胞自噬中所起作用的分子機制,我們應用AMPK特異性的抑制劑compound C處理HepG2和Bel-7402細胞。通過Western blot蛋白檢測結果,我們發(fā)現(xiàn)compound C降低了 Meloxicam誘導的AMPK的激活,同時,我們發(fā)現(xiàn)抑制AMPK的激活顯著降低了 LC3的表達。但是,Western blot蛋白檢測結果顯示應用mTOR特異性抑制劑rapamycin削弱了 compound C對LC3的調控作用。為了進一步證實AMPK-mTOR信號通路在Meloxicam抗肝癌細胞中起到重要的作用,我們評估了 compound C在Meloxicam誘導肝癌細胞凋亡中的作用。流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示compound C顯著增強了 Meloxicam對HepG2和Bel-7402細胞的殺傷力。表明AMPK-mTOR信號參與了肝癌細胞自噬的激活,而GRP78可能是通過AMPK-mTOR信號通路誘導HepG2和Bel-7402細胞自噬的激活。結論:1.COX-2抑制劑Meloxicam誘導內質網(wǎng)應激觸發(fā)肝癌細胞的凋亡,Caspases蛋白參與了這一進程;2.COX-2抑制劑Meloxicam誘導細胞自噬的激活增強了肝癌細胞凋亡抵抗的能力,削弱了內質網(wǎng)應激的壓力,抑制自噬能夠增強肝癌細胞內質網(wǎng)應激性凋亡;3.內質網(wǎng)分子伴侶GRP78可能是通過AMPK-mTOR信號通路參與了Meloxicam誘導的肝癌細胞自噬的激活。抑制GRP78能夠增強Meloxicam誘導肝癌細胞凋亡的能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1713132