本文選題：肝細(xì)胞肝癌　切入點：COX-2抑制劑　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是一種常見的嚴(yán)重威脅人類健康且惡性程度極高的消化道腫瘤。在世界范圍內(nèi),HCC的發(fā)病率居第6位,而致死率則居第2位。目前,僅有20%的HCC患者能夠接受有效的治療,針對中晚期HCC患者的有效治療手段仍然很少。索拉非尼是目前唯一被證實可改善進展期HCC患者生存情況的靶向藥物,但是與安慰劑相比較,索拉非尼僅僅能延長晚期HCC患者2-3個月的中位生存期。由此可見,深入探尋HCC惡性增殖以及凋亡抵抗的分子機制,尋找新策略和方法來改變目前HCC的治療現(xiàn)狀具有十分重要的意義。越來越多的證據(jù)顯示環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡抵抗。美洛昔康(Meloxicam)作為選擇性的COX-2抑制劑和非甾體類抗炎藥(NSAlD)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于炎癥的治療。此外,Meloxicam能夠通過降低COX-2的表達抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。但是,Meloxicam殺傷HCC的具體機制至今仍不不明了。HCC在其發(fā)生發(fā)展過程中要不斷應(yīng)對各種理化因素的刺激,肝癌細(xì)胞在應(yīng)對機體這種微環(huán)境的改變時必然會產(chǎn)生一系列反應(yīng)來改變其生物學(xué)行為或功能,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)就是HCC常見的一種應(yīng)激性反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路之間具有相互作用,因此,有必要闡明肝癌細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下增殖活性和凋亡抵抗能力的變化。自噬是細(xì)胞高度保守的過程,它通過形成自噬體將物質(zhì)轉(zhuǎn)運至溶酶體進行降解,是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機制。之前的研究結(jié)果顯示一些抗腫瘤治療能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞的自噬和凋亡,靶向作用于自噬能夠增強腫瘤化療的敏感性�；诖�,我們設(shè)計了本實驗來探討靶向作用于細(xì)胞自噬是否能夠通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡增強Meloxicam對肝癌細(xì)胞的殺傷力。方法:首先選取5種最為常見的人肝癌細(xì)胞系-HepG2、Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721 和 SMMC-7402,應(yīng)用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測這 5種肝癌細(xì)胞的細(xì)胞活力,篩選出其中對Meloxicam治療最為敏感的兩種細(xì)胞株(HepG2和Bel-7402)進行下一步實驗。應(yīng)用流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測HepG2和Bel-7402兩種肝癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度Meloxicam處理后細(xì)胞凋亡率的變化。采用Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE1,GRP78/Bip以及磷酸化eIF2α的表達。同時,應(yīng)用免疫熒光實驗(Immunofluorescence Assay)進一步檢測GRP78的定位表達情況。應(yīng)用Western blot檢測經(jīng)不同濃度Meloxicam處理后,HepG2和Bel-7402細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡特異性蛋白Caspase-12以及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3和PARP蛋白的表達。通過RT-PCR檢測Meloxicam對Caspase-12 mRNA表達的影響。另外,應(yīng)用細(xì)胞凋亡抑制劑(Z-VAD-FMK,Z-VAD)進一步探討Meloxicam誘導(dǎo)HepG2和Bel-7402細(xì)胞凋亡的分子機制。實驗中應(yīng)用小干擾RNA(siRNA)特異性沉默GRP78,然后應(yīng)用CCK-8檢測經(jīng)Meloxicam處理后,HepG2和Bel-7402的細(xì)胞活力;應(yīng)用Western blot檢測GRP78蛋白的表達情況;應(yīng)用流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率的變化。(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是 GRP78 的抑制劑,應(yīng)用 Annexin V/PI 雙染法和 Western blot 檢測 EGCG 對 Meloxicam 誘導(dǎo) HepG2和Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用Western blot檢測自噬激活的標(biāo)志性蛋白Beclin-1,Atg5,Atg7,LC3和p62的表達。然后應(yīng)用免疫熒光染色檢測經(jīng)Meloxicam處理后,HepG2和Bel-7402細(xì)胞LC3的變化。為了進一步探討自噬是否在Meloxicam介導(dǎo)的HepG2和Bel-7402細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用,我們應(yīng)用細(xì)胞自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和Atg5 siRNA特異性沉默Atg5來抑制Meloxicam誘導(dǎo)的HepG2和Bel-7402細(xì)胞自噬的激活。分別應(yīng)用流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法和Western blot檢測HepG2和Bel-7402細(xì)胞的凋亡率以及自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)蛋白LC3、Atg5和Caspase-12的表達情況。為了進一步研究GRP78蛋白是否參與了 Meloxicam誘導(dǎo)HepG2和Bel-7402細(xì)胞自噬的激活,分別應(yīng)用GRP78 siRNA和EGCG抑制GRP78蛋白的表達,應(yīng)用Western blot檢測HepG2和Bel-7402細(xì)胞白噬標(biāo)志蛋白LC3的表達。為了明確AMPK-mTOR信號通路在Meloxicam處理的HepG2和Bel-7402細(xì)胞中是否參與了 GRP78蛋白調(diào)控的細(xì)胞自噬,分別應(yīng)用GRP78 siRNA和EGCG抑制GRP78蛋白的表達,應(yīng)用Western blot檢測HepG2和Bel-7402細(xì)胞AMPK和mTOR的表達。為了進一步研究這其中的分子機制,分別應(yīng)用AMPK特異性抑制劑compound C和mTOR特異性抑制劑Rapamycin抑制AMPK和mTOR的表達,應(yīng)用Western blot檢測HepG2和Bel-7402細(xì)胞LC3的表達。結(jié)果:CCK-8實驗顯示經(jīng)不同濃度Meloxicam處理后,這五種肝癌細(xì)胞的細(xì)胞活力與對照組相比均有明顯的下降,并且在Meloxicam濃度為80μM時,對細(xì)胞活力的抑制率達到峰值。由于HepG2和Bel-7402兩種肝癌細(xì)胞對Meloxicam的敏感性較其它肝癌細(xì)胞高,因此,選擇這兩種細(xì)胞進行下一步實驗。流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡顯示Meloxicam能夠誘導(dǎo)HepG2和Bel-7402細(xì)胞凋亡,并且呈現(xiàn)出濃度依賴性。進一步研究其分子機制,Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示經(jīng)Meloxicam處理后,HepG2和Bel-7402細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白IRE1、GRP78/Bip以及磷酸化的eIF2αα明顯增高且呈現(xiàn)出濃度依賴性。免疫熒光染色的方法觀察GRP78的定位表達,結(jié)果顯示與對照組相比,Meloxicam能夠明顯增強GRP78的定位表達。Caspase-12的表達與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān),本實驗中,Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示Meloxicam激活了 Caspase-12的表達,這與細(xì)胞凋亡的分析結(jié)果是一致的。同時通過Western blot蛋白檢測我們也觀察到凋亡執(zhí)行蛋白Casapse-3和PARP的表達也隨著Meloxciam濃度的增加而上調(diào)。RT-PCR結(jié)果顯示Meloxicam同樣能夠增強Caspase-12 mRNA的表達。另外,我們應(yīng)用凋亡抑制劑Z-VAD來分析Meloxciam對HepG2和Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡顯示Z-VAD明顯降低了Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。說明Meloxicam導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠觸發(fā)HepG2和Bel-7402細(xì)胞的凋亡,同時Caspases蛋白參與了這一過程。應(yīng)用GRP78 siRNA特異性沉默HepG2和Bel-7402細(xì)胞中GRP78的表達。CCK-8細(xì)胞活力檢測發(fā)現(xiàn)抑制GRP78明顯降低了肝癌細(xì)胞的細(xì)胞活力。Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示與對照組相比,GRP78 siRNA明顯降低了肝癌細(xì)胞GRP78的表達,同時流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示抑制GRP78的表達能夠明顯增強Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的能力。接下來,我們應(yīng)用GRP78特異性的抑制劑EGCG繼續(xù)探討Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機制。Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示與對照組相比,EGCG明顯下調(diào)了 HepG2和Bel-7402細(xì)胞中GRP78的表達,流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示聯(lián)合EGCG能夠顯著增強Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的能力。通過Western blot蛋白檢測,我們發(fā)現(xiàn)Meloxicam顯著增強了自噬標(biāo)志性蛋白Beclin-1,、Atg5、Atg7 和 LC3 的表達,相反,Meloxicam 下調(diào)了 HepG2 和 Bel-7402細(xì)胞中p62蛋白的表達。為了進一步證實Western blot的檢測結(jié)果,我們對LC3進行免疫熒光染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,Meloxicam明顯增強了肝癌細(xì)胞中LC3的定位表達。接下來,我們探討自噬在Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡中起到何種作用。我們應(yīng)用細(xì)胞自噬特異性的抑制劑3-MA抑制HepG2和Bel-7402細(xì)胞的自噬。流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡顯示3-MA明顯增強了 Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的能力,而3-MA單獨用藥并不能明顯導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡。Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示3-MA降低了 LC3的表達,相反,上調(diào)了 Caspase-12的表達。接下來,我們應(yīng)用Atg5siRNA特異性干擾Atg5的表達抑制自噬,同樣通過流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡以及Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示抑制Atg5的表達顯著增強了Meloxicam介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性的細(xì)胞凋亡。通過Western blot實驗我們發(fā)現(xiàn)抑制GRP78蛋白的表達能夠下調(diào)HepG2和Bel-7402細(xì)胞LC3的表達。表明下調(diào)GRP78蛋白的表達能夠抑制Meloxicam誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬的激活。AMPK-mTOR信號通路在細(xì)胞自噬的調(diào)控中起到重要的作用。因此,我們探討該信號通路是否參與了 GRP78調(diào)控肝癌細(xì)胞自噬的激活。Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示Meloxicam激活了 AMPK但是抑制了 mTOR的磷酸化。相反,應(yīng)用GRP78 siRNA或者EGCG則抑制了 AMPK,而增強了 mTOR的磷酸化。為了進一步研究AMPK-mTOR信號通路在Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬中所起作用的分子機制,我們應(yīng)用AMPK特異性的抑制劑compound C處理HepG2和Bel-7402細(xì)胞。通過Western blot蛋白檢測結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)compound C降低了 Meloxicam誘導(dǎo)的AMPK的激活,同時,我們發(fā)現(xiàn)抑制AMPK的激活顯著降低了 LC3的表達。但是,Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示應(yīng)用mTOR特異性抑制劑rapamycin削弱了 compound C對LC3的調(diào)控作用。為了進一步證實AMPK-mTOR信號通路在Meloxicam抗肝癌細(xì)胞中起到重要的作用,我們評估了 compound C在Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用。流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡顯示compound C顯著增強了 Meloxicam對HepG2和Bel-7402細(xì)胞的殺傷力。表明AMPK-mTOR信號參與了肝癌細(xì)胞自噬的激活,而GRP78可能是通過AMPK-mTOR信號通路誘導(dǎo)HepG2和Bel-7402細(xì)胞自噬的激活。結(jié)論:1.COX-2抑制劑Meloxicam誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)肝癌細(xì)胞的凋亡,Caspases蛋白參與了這一進程;2.COX-2抑制劑Meloxicam誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的激活增強了肝癌細(xì)胞凋亡抵抗的能力,削弱了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的壓力,抑制自噬能夠增強肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡;3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78可能是通過AMPK-mTOR信號通路參與了Meloxicam誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬的激活。抑制GRP78能夠增強Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1713132