本文選題：miR-340　切入點：肝癌　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：一、研究背景及目的肝細胞癌(HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一。目前的治療措施主要有手術切除、化療和肝移植等。但是由于HCC較高的肝外轉(zhuǎn)移和術后復發(fā)率,5年生存時間依然較低。盡管科學家們在肝癌的研究領域付出了艱辛的努力也取得了很多的成果,但HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制目前仍不明確。JAK激酶是非受體酪氨酸激酶家族中的一員,包括JAK1,JAK2,JAK3和TYK2。能夠在各種細胞因子和生長因素作用下激活STAT(signal transducer and activator of transcription)蛋白。JAK1/STAT信號通路在正常的細胞中被嚴格監(jiān)控。但在癌細胞中它會被JAK家族激酶或其他的酪氨酸激酶持續(xù)激活。在所有的JAK1/STAT家族中,JAK1/STAT3起著很重要的生物學作用,如細胞的增長、凋亡、遷移和入侵。在不同類型的腫瘤,比如HCC、頭頸部腫瘤、乳腺癌、肺癌等中STAT3都會被異常激活。最近的研究表明,持續(xù)激活JAK1/STAT3與腫瘤發(fā)生和癌癥進展相關。所以JAK1/STAT3信號通路有望成為治療癌癥的新途徑。Micro RNA(miRNA)是一種大小約21~25個堿基的非編碼小RNA。近來研究表明,miRNA通過抑制特定的癌基因或抑癌基因,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。miRNA通過靶向癌基因或抑癌基因發(fā)揮類似腫瘤抑制因子的作用,參與腫瘤的轉(zhuǎn)化、生長、血管生成及EMT等多種過程。越來越多的證據(jù)表明miRNA表達失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。miR-340在多種腫瘤中表達下調(diào)。然而,miR-340抑制肝細胞癌的作用機理尚不清楚。我們探討miR-340在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)作用及其分子機制,為尋找新的肝癌治療靶點提供理論依據(jù)。二、材料與方法1.細胞培養(yǎng)人類HCC細胞系(SK-Hep-1,Hep G2,HCCLM3和MHCC97-H)、人類肝細胞系L02購自中科院(上海)。用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃,5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)細胞。2.病人和組織標本從本院手術室獲取32例手術切除的HCC腫瘤及癌旁組織標本。所有病人在手術前未進行過放療或化療等治療。經(jīng)過了所有病人或家屬的知情同意并于術前簽署了知情同意書。該研究經(jīng)過了倫理委員會批準。3.質(zhì)粒構(gòu)建細胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimics,antagomir-340及其陰性對照購自廣州市銳博生物科技有限公司。過表達miR-340的慢病毒和陰性對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司。通過PCR擴增JAK1的野生型3'-UTR,其含有miR-340結(jié)合位點。在miR-340結(jié)合位點序列中產(chǎn)生突變。將PCR產(chǎn)物插入p GL3-對照熒光素酶載體(Promega)中。對于JAK1過表達,將JAK1的開放閱讀框插入pc DNA3.1載體中。使用Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen)根據(jù)制造商的方案進行轉(zhuǎn)染。4.RNA提取和q RT-PCR使用mir VANA RNA分離試劑盒根據(jù)制造商的方案從細胞系和冷凍的腫瘤樣品提取總RNA。使用Prime Script RT試劑盒(Ta Ka Ra)進行互補DNA合成。在ABI 7900系統(tǒng)(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)中用SYBR green Premix Ex Taq II(Ta Ka Ra)進行q RT-PCR。β-actin或U6用作內(nèi)源對照。根據(jù)2-△△CT方法計算靶基因的相對表達水平。5.MTT和克隆形成實驗通過MTT測定評估細胞活力。將細胞以4×103個細胞/孔的密度接種在96孔板中,并在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1,2,3和4天。將體積為100μl的MTT(0.5mg/ml,Invitrogen)加入96孔板的每個孔中,并將細胞在37℃下再溫育4小時,隨后除去上清液,并加入150μl的二甲基亞砜(Sigma,St.Louis,MO)。使用酶標儀(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)測量490nm處的吸光度。對于克隆形成測定,將轉(zhuǎn)染的細胞以每孔1000個細胞的密度在6孔板中培養(yǎng)并生長12天。用甲醇固定后,用0.1%結(jié)晶紫染色菌落15分鐘并洗滌。在光學顯微鏡下計數(shù)菌落數(shù)。6.侵襲實驗使用涂有Matrigel膠(BD Biosciences,San Jose,CA)的24孔Transwell室檢測細胞的侵襲能力。將總共1×104個轉(zhuǎn)染的細胞在無血清培養(yǎng)基中接種在上室中。下室充滿含有10%FBS的DMEM作為化學引誘物。孵育48小時后,將粘附在膜下側(cè)的細胞固定,染色并使用顯微鏡計數(shù)。7.劃痕實驗將轉(zhuǎn)染的細胞在24孔板中培養(yǎng)。用200μL移液管尖端刮擦細胞層,觀察愈合過程。在劃傷后一定時間測量劃痕寬度,以評估細胞的遷移能力。8.Western blotting抽提總蛋白,通過SDS-PAGE分離,并電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore,Billerica,MA)上,然后進行免疫雜交、顯影及定影。9.熒光素酶活性檢測將熒光素酶報告基因載體瞬時轉(zhuǎn)染48小時后,通過雙熒光素酶報告測定系統(tǒng)(Promega)檢測熒光素酶活性。10.裸鼠成瘤實驗將感染慢病毒Lv-miR-340的HCCLM3細胞(2×106)皮下注射到5周齡BALB/C裸鼠中。每5天使用卡尺測量腫瘤體積:V(mm3)=0.5×長度×寬度的平方。30天后處死裸鼠并摘取腫瘤稱重,拍照,固定并包埋。11.統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。用T檢驗評估兩組之間的顯著性。Spearman相關性檢驗用于檢查miR-340和JAK1表達之間的相關性。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS13.0進行,統(tǒng)計學顯著性設為P0.05。三、實驗結(jié)果1.miR-340在HCC組織和細胞系表達下調(diào)在32例HCC組織樣本和相對應的癌旁無瘤肝組織中通過q RT-PCR評估m(xù)iR-340的表達水平。結(jié)果顯示在HCC組織中miR-340的表達顯著低于相對應的癌旁無瘤組織。之后,我們檢測了miR-340在4種肝癌細胞系(Hep G2,SK-HEP-1,HCCLM3和MHCC97-H)和1種人類正常肝組織細胞系LO2。與腫瘤組織的表達一致,與LO2細胞系相比在4種HCC細胞系中miR-340表達抑制。這些結(jié)果表明miR-340的表達下調(diào)可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程當中起著重要的作用。2.miR-340對HCC細胞增殖、遷移和入侵的影響研究miR-340在HCC的發(fā)生發(fā)展中的生物學功能。HCC細胞系HCCLM3、MHCC97-H分別轉(zhuǎn)染miR-340 mimics及其對照miR-control。轉(zhuǎn)染48h后,分別收獲對數(shù)生長中期、生長狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染細胞系,應用細胞培養(yǎng)液制成單細胞懸液,每孔接種2×103個細胞。每組設8個平行孔。MTT實驗結(jié)果表明相比于對照組過表達miR-340細胞活性降低�？寺⌒纬蓪嶒烇@示與對照組相比兩種細胞系的miR-340過表達組克隆形成能力顯著降低。之后我們研究了miR-340對HCC細胞遷移和侵襲能力的影響,劃痕實驗的數(shù)據(jù)顯示,相比于對照組過表達miR-340的HCCLM3和MHCC97-H細胞降低了劃痕關閉能力。Transwell小室過表達miR-340的細胞穿膜細胞數(shù)量顯著降低。另一方面,我們將Hep G2轉(zhuǎn)染antagomir-340及其對照(終濃度為100n M)。正如預期的,結(jié)果表明抑制miR-340的表達顯著增強了Hep G2細胞的增殖、遷移和侵襲能力。這些結(jié)果都表明miR-340可顯著地抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力。3.miR-340過表達對裸鼠HCC移植瘤的影響前邊的實驗都說明了miR-340具有抑制HCC的作用。為了進一步了解其作用,我們設計了裸鼠成瘤實驗模型。LM3感染慢病毒Lv-miR-340及其對照(購自漢恒生物),收集對數(shù)生長期的感染細胞及對照細胞,PBS洗兩次后,制成100μl含1×106個細胞的單細胞懸液。用75%酒精消毒裸鼠肩胛骨部位,抽取上述細胞懸液進行注射,將裸鼠飼養(yǎng)于無菌飼養(yǎng)室中。待瘤體形成后,密切觀察腫瘤生長情況,用游標卡尺測量腫瘤大小(長L、寬W),計算腫瘤體積V=0.5×L×W2,繪制腫瘤的生長曲線。30天后處死裸鼠并摘取腫瘤稱重。與體外結(jié)果一致,miR-340過表達抑制體內(nèi)腫瘤的生長,過表達組腫瘤的尺寸大小和重量都明顯小于對照。我們將皮下種植瘤標本進行了q RT-PCR分析,結(jié)果確認了在miR-340過表達組中miR-340是高表達的。將皮下種植瘤標本進行免疫組化,miR-340過表達組中細胞增殖標記物Ki67相比于對照組中明顯減少,說明HCC細胞增殖活動減弱。這些數(shù)據(jù)表明miR-340在體內(nèi)同樣抑制HCC細胞的生長。4.miR-340作用靶標JAK1以上的實驗表明miR-340可在體內(nèi)體外顯著地抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲。我們使用在線公開的數(shù)據(jù)庫(Target Scan和miRanda)來預測miR-340的靶基因。JAK1在惡性腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用,被認為是一個潛在的靶標。我們用熒光素酶實驗來評估JAK1是否是miR-340的直接靶標。miR-340過表達會降低JAK1的信使RNA 3'-UTR熒光素酶的活性,而JAK1信使RNA 3'-UTR突變型熒光素酶沒有影響。結(jié)果顯示在HCCLM3和MHCC97-H細胞中轉(zhuǎn)染miR-340 mimics抑制JAK1的表達。我們用Western blot實驗分析JAK1蛋白在幾種HCC細胞系中的表達,與對照組相比miR-340組JAK1低表達。這些結(jié)果表明miR-340通過直接作用于JAK1的3'-UTR調(diào)控JAK1表達。5.JAK1表達的改變影響miR-340對HCC細胞的作用miR-340可以直接作用于JAK1,使得我們想進一步探索其中機制。我們通過功能分析來驗證這種假設。LM3細胞轉(zhuǎn)染miR-control、miR-340 mimics、miR-340mimics+pc DNA3.1/JAK1。通過Western blot分析JAK1蛋白的表達情況。結(jié)果顯示缺失3'-UTR的JAK1信使RNA部分消除了miR-340對HCC細胞的抑制作用。6.miR-340調(diào)節(jié)JAK1/STAT3信號通路。JAK1/STAT3信號通路是一個與腫瘤生長于轉(zhuǎn)移相關的生物信號通路。通過研究JAK1/STAT3主要靶基因的表達探索miR-340是否是通過調(diào)節(jié)JAK1/STAT3信號通路來調(diào)控HCC細胞的發(fā)生發(fā)展。在轉(zhuǎn)染miR-340 mimics的HCCLM3、MHCC97-H細胞中p-STAT3,Bcl-2,cyclin D1和MMP2表達水平明顯減少。相反的,在同時轉(zhuǎn)染了miR-340 mimics和JAK1質(zhì)粒的細胞中這些分子的表達顯著增加。這些結(jié)果表明JAK1/STAT3信號通路有效的參與了miR-340對HCC細胞生長和侵襲的作用過程。四、結(jié)論我們的研究表明miR-340通過調(diào)節(jié)JAK1/STAT3途徑抑制HCC的增殖、遷移和入侵,表明其有望成為治療HCC的新靶標。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：1711580