本文選題：miR-340　切入點(diǎn)：肝癌　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：一、研究背景及目的肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一。目前的治療措施主要有手術(shù)切除、化療和肝移植等。但是由于HCC較高的肝外轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)率,5年生存時(shí)間依然較低。盡管科學(xué)家們在肝癌的研究領(lǐng)域付出了艱辛的努力也取得了很多的成果,但HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制目前仍不明確。JAK激酶是非受體酪氨酸激酶家族中的一員,包括JAK1,JAK2,JAK3和TYK2。能夠在各種細(xì)胞因子和生長因素作用下激活STAT(signal transducer and activator of transcription)蛋白。JAK1/STAT信號(hào)通路在正常的細(xì)胞中被嚴(yán)格監(jiān)控。但在癌細(xì)胞中它會(huì)被JAK家族激酶或其他的酪氨酸激酶持續(xù)激活。在所有的JAK1/STAT家族中,JAK1/STAT3起著很重要的生物學(xué)作用,如細(xì)胞的增長、凋亡、遷移和入侵。在不同類型的腫瘤,比如HCC、頭頸部腫瘤、乳腺癌、肺癌等中STAT3都會(huì)被異常激活。最近的研究表明,持續(xù)激活JAK1/STAT3與腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展相關(guān)。所以JAK1/STAT3信號(hào)通路有望成為治療癌癥的新途徑。Micro RNA(miRNA)是一種大小約21~25個(gè)堿基的非編碼小RNA。近來研究表明,miRNA通過抑制特定的癌基因或抑癌基因,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。miRNA通過靶向癌基因或抑癌基因發(fā)揮類似腫瘤抑制因子的作用,參與腫瘤的轉(zhuǎn)化、生長、血管生成及EMT等多種過程。越來越多的證據(jù)表明miRNA表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-340在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)。然而,miR-340抑制肝細(xì)胞癌的作用機(jī)理尚不清楚。我們探討miR-340在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制,為尋找新的肝癌治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。二、材料與方法1.細(xì)胞培養(yǎng)人類HCC細(xì)胞系(SK-Hep-1,Hep G2,HCCLM3和MHCC97-H)、人類肝細(xì)胞系L02購自中科院(上海)。用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃,5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞。2.病人和組織標(biāo)本從本院手術(shù)室獲取32例手術(shù)切除的HCC腫瘤及癌旁組織標(biāo)本。所有病人在手術(shù)前未進(jìn)行過放療或化療等治療。經(jīng)過了所有病人或家屬的知情同意并于術(shù)前簽署了知情同意書。該研究經(jīng)過了倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。3.質(zhì)粒構(gòu)建細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimics,antagomir-340及其陰性對(duì)照購自廣州市銳博生物科技有限公司。過表達(dá)miR-340的慢病毒和陰性對(duì)照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。通過PCR擴(kuò)增JAK1的野生型3'-UTR,其含有miR-340結(jié)合位點(diǎn)。在miR-340結(jié)合位點(diǎn)序列中產(chǎn)生突變。將PCR產(chǎn)物插入p GL3-對(duì)照熒光素酶載體(Promega)中。對(duì)于JAK1過表達(dá),將JAK1的開放閱讀框插入pc DNA3.1載體中。使用Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染。4.RNA提取和q RT-PCR使用mir VANA RNA分離試劑盒根據(jù)制造商的方案從細(xì)胞系和冷凍的腫瘤樣品提取總RNA。使用Prime Script RT試劑盒(Ta Ka Ra)進(jìn)行互補(bǔ)DNA合成。在ABI 7900系統(tǒng)(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)中用SYBR green Premix Ex Taq II(Ta Ka Ra)進(jìn)行q RT-PCR。β-actin或U6用作內(nèi)源對(duì)照。根據(jù)2-△△CT方法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。5.MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)通過MTT測定評(píng)估細(xì)胞活力。將細(xì)胞以4×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中,并在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1,2,3和4天。將體積為100μl的MTT(0.5mg/ml,Invitrogen)加入96孔板的每個(gè)孔中,并將細(xì)胞在37℃下再溫育4小時(shí),隨后除去上清液,并加入150μl的二甲基亞砜(Sigma,St.Louis,MO)。使用酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)測量490nm處的吸光度。對(duì)于克隆形成測定,將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以每孔1000個(gè)細(xì)胞的密度在6孔板中培養(yǎng)并生長12天。用甲醇固定后,用0.1%結(jié)晶紫染色菌落15分鐘并洗滌。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)菌落數(shù)。6.侵襲實(shí)驗(yàn)使用涂有Matrigel膠(BD Biosciences,San Jose,CA)的24孔Transwell室檢測細(xì)胞的侵襲能力。將總共1×104個(gè)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中接種在上室中。下室充滿含有10%FBS的DMEM作為化學(xué)引誘物。孵育48小時(shí)后,將粘附在膜下側(cè)的細(xì)胞固定,染色并使用顯微鏡計(jì)數(shù)。7.劃痕實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)。用200μL移液管尖端刮擦細(xì)胞層,觀察愈合過程。在劃傷后一定時(shí)間測量劃痕寬度,以評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。8.Western blotting抽提總蛋白,通過SDS-PAGE分離,并電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore,Billerica,MA)上,然后進(jìn)行免疫雜交、顯影及定影。9.熒光素酶活性檢測將熒光素酶報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,通過雙熒光素酶報(bào)告測定系統(tǒng)(Promega)檢測熒光素酶活性。10.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)將感染慢病毒Lv-miR-340的HCCLM3細(xì)胞(2×106)皮下注射到5周齡BALB/C裸鼠中。每5天使用卡尺測量腫瘤體積:V(mm3)=0.5×長度×寬度的平方。30天后處死裸鼠并摘取腫瘤稱重,拍照,固定并包埋。11.統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。用T檢驗(yàn)評(píng)估兩組之間的顯著性。Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)用于檢查miR-340和JAK1表達(dá)之間的相關(guān)性。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS13.0進(jìn)行,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)為P0.05。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.miR-340在HCC組織和細(xì)胞系表達(dá)下調(diào)在32例HCC組織樣本和相對(duì)應(yīng)的癌旁無瘤肝組織中通過q RT-PCR評(píng)估m(xù)iR-340的表達(dá)水平。結(jié)果顯示在HCC組織中miR-340的表達(dá)顯著低于相對(duì)應(yīng)的癌旁無瘤組織。之后,我們檢測了miR-340在4種肝癌細(xì)胞系(Hep G2,SK-HEP-1,HCCLM3和MHCC97-H)和1種人類正常肝組織細(xì)胞系LO2。與腫瘤組織的表達(dá)一致,與LO2細(xì)胞系相比在4種HCC細(xì)胞系中miR-340表達(dá)抑制。這些結(jié)果表明miR-340的表達(dá)下調(diào)可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程當(dāng)中起著重要的作用。2.miR-340對(duì)HCC細(xì)胞增殖、遷移和入侵的影響研究miR-340在HCC的發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能。HCC細(xì)胞系HCCLM3、MHCC97-H分別轉(zhuǎn)染miR-340 mimics及其對(duì)照miR-control。轉(zhuǎn)染48h后,分別收獲對(duì)數(shù)生長中期、生長狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,每孔接種2×103個(gè)細(xì)胞。每組設(shè)8個(gè)平行孔。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相比于對(duì)照組過表達(dá)miR-340細(xì)胞活性降低。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組相比兩種細(xì)胞系的miR-340過表達(dá)組克隆形成能力顯著降低。之后我們研究了miR-340對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,劃痕實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示,相比于對(duì)照組過表達(dá)miR-340的HCCLM3和MHCC97-H細(xì)胞降低了劃痕關(guān)閉能力。Transwell小室過表達(dá)miR-340的細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)量顯著降低。另一方面,我們將Hep G2轉(zhuǎn)染antagomir-340及其對(duì)照(終濃度為100n M)。正如預(yù)期的,結(jié)果表明抑制miR-340的表達(dá)顯著增強(qiáng)了Hep G2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。這些結(jié)果都表明miR-340可顯著地抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。3.miR-340過表達(dá)對(duì)裸鼠HCC移植瘤的影響前邊的實(shí)驗(yàn)都說明了miR-340具有抑制HCC的作用。為了進(jìn)一步了解其作用,我們設(shè)計(jì)了裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀M3感染慢病毒Lv-miR-340及其對(duì)照(購自漢恒生物),收集對(duì)數(shù)生長期的感染細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞,PBS洗兩次后,制成100μl含1×106個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。用75%酒精消毒裸鼠肩胛骨部位,抽取上述細(xì)胞懸液進(jìn)行注射,將裸鼠飼養(yǎng)于無菌飼養(yǎng)室中。待瘤體形成后,密切觀察腫瘤生長情況,用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小(長L、寬W),計(jì)算腫瘤體積V=0.5×L×W2,繪制腫瘤的生長曲線。30天后處死裸鼠并摘取腫瘤稱重。與體外結(jié)果一致,miR-340過表達(dá)抑制體內(nèi)腫瘤的生長,過表達(dá)組腫瘤的尺寸大小和重量都明顯小于對(duì)照。我們將皮下種植瘤標(biāo)本進(jìn)行了q RT-PCR分析,結(jié)果確認(rèn)了在miR-340過表達(dá)組中miR-340是高表達(dá)的。將皮下種植瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化,miR-340過表達(dá)組中細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67相比于對(duì)照組中明顯減少,說明HCC細(xì)胞增殖活動(dòng)減弱。這些數(shù)據(jù)表明miR-340在體內(nèi)同樣抑制HCC細(xì)胞的生長。4.miR-340作用靶標(biāo)JAK1以上的實(shí)驗(yàn)表明miR-340可在體內(nèi)體外顯著地抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。我們使用在線公開的數(shù)據(jù)庫(Target Scan和miRanda)來預(yù)測miR-340的靶基因。JAK1在惡性腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用,被認(rèn)為是一個(gè)潛在的靶標(biāo)。我們用熒光素酶實(shí)驗(yàn)來評(píng)估JAK1是否是miR-340的直接靶標(biāo)。miR-340過表達(dá)會(huì)降低JAK1的信使RNA 3'-UTR熒光素酶的活性,而JAK1信使RNA 3'-UTR突變型熒光素酶沒有影響。結(jié)果顯示在HCCLM3和MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-340 mimics抑制JAK1的表達(dá)。我們用Western blot實(shí)驗(yàn)分析JAK1蛋白在幾種HCC細(xì)胞系中的表達(dá),與對(duì)照組相比miR-340組JAK1低表達(dá)。這些結(jié)果表明miR-340通過直接作用于JAK1的3'-UTR調(diào)控JAK1表達(dá)。5.JAK1表達(dá)的改變影響miR-340對(duì)HCC細(xì)胞的作用miR-340可以直接作用于JAK1,使得我們想進(jìn)一步探索其中機(jī)制。我們通過功能分析來驗(yàn)證這種假設(shè)。LM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-control、miR-340 mimics、miR-340mimics+pc DNA3.1/JAK1。通過Western blot分析JAK1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示缺失3'-UTR的JAK1信使RNA部分消除了miR-340對(duì)HCC細(xì)胞的抑制作用。6.miR-340調(diào)節(jié)JAK1/STAT3信號(hào)通路。JAK1/STAT3信號(hào)通路是一個(gè)與腫瘤生長于轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物信號(hào)通路。通過研究JAK1/STAT3主要靶基因的表達(dá)探索miR-340是否是通過調(diào)節(jié)JAK1/STAT3信號(hào)通路來調(diào)控HCC細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。在轉(zhuǎn)染miR-340 mimics的HCCLM3、MHCC97-H細(xì)胞中p-STAT3,Bcl-2,cyclin D1和MMP2表達(dá)水平明顯減少。相反的,在同時(shí)轉(zhuǎn)染了miR-340 mimics和JAK1質(zhì)粒的細(xì)胞中這些分子的表達(dá)顯著增加。這些結(jié)果表明JAK1/STAT3信號(hào)通路有效的參與了miR-340對(duì)HCC細(xì)胞生長和侵襲的作用過程。四、結(jié)論我們的研究表明miR-340通過調(diào)節(jié)JAK1/STAT3途徑抑制HCC的增殖、遷移和入侵,表明其有望成為治療HCC的新靶標(biāo)。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1711580