發(fā)布時間：2018-04-04 20:19

  本文選題：吳茱萸堿　切入點：血管生成　出處：《南京醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：常用中藥吳茱萸為蕓香科植物,藥理作用主要表現(xiàn)在對于心血管系統(tǒng)和胃腸道的影響以及具有一定的抗腫瘤的作用。吳茱萸堿是吳茱萸中所含的一種色胺吲哚類生物堿,具有調節(jié)免疫、抑制脂肪細胞分化、抗炎等作用。有研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿對宮頸癌、前列腺癌和結腸癌多種癌癥具有抗腫瘤作用,但其抗腫瘤作用機制尚不清楚�？寡苌傻乃幬锿ǔ？梢种苾绕ぜ毎娜肭�,通過抑制細胞外調節(jié)蛋白激酶的活化,抑制血管內皮生長因子表達。Wnt/β-catenin信號通路與血管的發(fā)育和重建關系密切。β-catenin可通過血管生成因子、成纖維生長因子以及E4局部腺病毒等保持自身穩(wěn)定,促進血管生成反應。血管內皮抑制素發(fā)揮抗血管生成作用在某種程度上也是通過誘導β-catenin退化來實現(xiàn)的。本課題在肝癌中對吳茱萸堿抗血管生成與β-catenin信號通路的關聯(lián)性進行研究。首先在不同整體動物模型、不同肝癌細胞系上驗證吳茱萸堿的抗肝癌效應;通過體內和體外實驗檢測吳茱萸堿的抗血管生成作用;利用Western Blot、Realtime PCR、EMSA等方法在肝癌細胞中探討β-catenin與血管生成的關聯(lián)性并觀察吳茱萸堿對其影響,從而發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿的抗肝癌效果及其分子機制,為進一步開發(fā)應用吳茱萸堿及尋找肝癌有效的早期生物學標志和抗腫瘤藥物提供一定的科學依據。第一部分吳茱萸堿抗肝癌作用的研究目的:探討吳茱萸堿對裸鼠肝癌移植瘤發(fā)生發(fā)展及肝癌HepG2和SMMC-7721細胞增殖、細胞周期、凋亡及侵襲轉移能力的影響。方法:選取了 H22 ICR小鼠和裸鼠肝癌移植瘤模型、人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤模型,觀察吳茱萸堿對模型動物移植瘤重、瘤體積、抑瘤率、腫瘤標志物甲胎蛋白(AFP)、腫瘤特異性生長因子(TSGF)以及病理組織學的影響;另采用MTT、流式細胞術、細胞劃痕試驗、transwell小室試驗等方法檢測吳茱萸堿對肝癌細胞HepG2和SMMC-7721的影響。結果:吳茱萸堿對小鼠或裸鼠H22肝癌移植瘤的抑瘤率可達40%以上;移植瘤生長曲線顯示,治療開始到第5天,吳茱萸組即表現(xiàn)出較模型組生長緩慢,至第14天實驗結束,對H22小鼠或裸鼠移植瘤的生長均有明顯的抑制作用;吳茱萸堿能顯著降低小鼠或裸鼠血清中腫瘤標記物AFP和TSGF的濃度;病理組織學檢查提示,吳茱萸堿組小鼠或裸鼠移植瘤壞死程度較模型組明顯,以凝固性壞死為主。在人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤模型中,吳茱萸堿組裸鼠在接種后,瘤體積生長、實驗結束所取瘤組織重量均小于模型組,但未見統(tǒng)計學差異;動物瘤組織進行病理組織學檢查,吳茱萸堿組腫瘤壞死程度明顯高于模型組,提示藥物有明顯的抗肝癌作用。MTT法檢測顯示吳茱萸堿對肝癌細胞HepG2和SMMC-7721均有明顯的抑制作用,隨著濃度的增加抑制率增加。流式細胞術檢測吳茱萸堿對人肝癌細胞HepG2和SMMC-7721細胞周期的影響,結果顯示,吳茱萸堿作用于HepG2和SMMC-7721細胞后,G2/M期細胞明顯增加。吳茱萸堿20 umol/L對腫瘤細胞的凋亡率可達到40%。劃痕實驗顯示吳茱萸堿能夠抑制HepG2和SMMC-7721肝癌細胞的遷移。在顯微鏡下觀察經結晶紫染色后穿透Transwell小室的肝癌細胞數(shù)量,吳茱萸組細胞數(shù)量明顯減少,差異有顯著性。結論:吳茱萸堿可抑制小鼠或裸鼠肝癌移植瘤的生長,且通過引起肝癌細胞HepG2和SMMC-7721周期阻滯和細胞凋亡而抑制肝癌細胞生長和侵襲轉移能力。第二部分吳茱萸堿對血管生成的影響目的:在細胞、組織和動物水平較系統(tǒng)地探討吳茱萸堿對血管生成的影響。方法:觀察不同吳茱萸堿處理分別對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的血管形成和大鼠主動脈環(huán)及經典的基質膠栓形成的影響。結果:吳茱萸堿可明顯抑制HUVEC微管生成,已經完全抑制了 HUVEC細胞小管的形成。同時,吳茱萸堿可顯著抑制主動脈環(huán)在基質膠內形成的微血管樣結構。在基質膠栓模型中,吳茱萸堿可明顯抑制膠栓中的血管生成,HE染色和基質膠的免疫組化CD31結果均顯示,藥物可以在體內明顯減少VEGF誘導的血管生成,給藥組血管數(shù)量及血管密度明顯減少。結論:吳茱萸堿在細胞、組織和動物水平均可抑制血管生成。第三部分吳茱萸堿抑制β-catenin介導的血管生成目的:探討吳茱萸堿對肝癌細胞β-catenin和VEGFa分子的影響及其在抑制血管生成和抗肝癌中的作用,闡明吳茱萸堿抗肝癌的部分分子機制。方法:運用免疫組織化學、Western Blot和qRT-PCR等方法觀察吳茱萸堿對肝癌H22和SMMC-7721細胞的裸鼠肝癌移植瘤組織及肝癌HepG2細胞β-catenin信號通路及血管生成相關因子的影響。結果:吳茱萸堿組可顯著抑制瘤組織中CD31、CD34、VEGFa、VEGFR1、MMP9及β-catenin蛋白的表達水平,且對瘤組織β-catenin mRNA也有一定的抑制。使用不同劑量的吳茱萸堿處理HepG2細胞,發(fā)現(xiàn)藥物可抑制細胞β-catenin的表達,尤其可明顯抑制β-catenin在核中的表達。吳茱萸堿可明顯阻滯高表達Frizzled7及β-catenin激動劑LiCl所致肝癌細胞β-catenin和VEGFa表達水平的升高;吳茱萸堿處理后的條件培養(yǎng)液可明顯抑制HUVEC細胞微管生成;另采用EMSA實驗發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿可明顯減少β-catenin與VEGFa DNA結合量,提示吳茱萸堿在肝癌細胞中可抑制β-catenin的活化,從而抑制VEGFa的轉錄活性。結論:吳茱萸堿通過抑制β-catenin而降低VEGFa轉錄活性,從而阻滯血管形成而發(fā)揮抗肝癌作用。綜上所述,本研究主要發(fā)現(xiàn):1、吳茱萸堿可抑制小鼠或裸鼠肝癌移植瘤的生長,且通過引起肝癌細胞HepG2和SMMC-7721周期阻滯和細胞凋亡而抑制肝癌細胞生長和侵襲轉移能力。2、吳茱萸堿在細胞、組織和動物水平上均可抑制血管生成。3、吳茱萸堿可能通過抑制β-catenin而降低VEGFa轉錄活性,從而阻滯血管形成而發(fā)揮抗肝癌作用。
[Abstract]:The effects of Evodiamine on the growth , cell cycle , cell cycle , apoptosis and invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma ( HCC ) were studied . The effects of Evodiamine on the growth , cell cycle , apoptosis and invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma ( HCC ) were studied . The results showed that Evodipine inhibited the growth of hepatoma cells and inhibited the growth and invasion of hepatocellular carcinoma cells . Conclusion : Evodipine can inhibit the growth of hepatoma cells and inhibit angiogenesis by inhibiting 尾 - catenin .

【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【共引文獻】

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本文編號：1711528