本文選題：胃癌　切入點：RKIP　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：第一部分RKIP通過microRNA-224調(diào)控抑制胃癌細胞增殖遷移,促進凋亡背景：胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第四位,死亡率居第二位,是最常見的惡性腫瘤之一。而胃癌患者的5年生存率并不高,要改變目前的狀態(tài),闡明其發(fā)病機制顯得尤為重要。胃癌的發(fā)生與腸上皮化生、慢性萎縮性胃炎、不典型增生等癌前病變密切相關(guān),涉及多種基因的異常。而miRNA在其過程中起重要作用,miRNA能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控各種關(guān)鍵基因。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)家族成員之一。RKIP能阻斷MAPK信號傳導(dǎo)通路的活性,抑制Raf-1介導(dǎo)的MEK的活化,進而抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移,已成為腫瘤領(lǐng)域的一個新的熱點。本研究檢測RKIP在人胃癌細胞中的表達情況,和對胃癌細胞SGC-7901生物學(xué)特性的影響,并觀察microRNA-224(miR-224)對靶基因RKIP表達調(diào)控作用,為胃癌治療提供新的治療方法和策略。方法：定量實時PCR檢測RKIP在胃癌細胞系(SGC-7901、MGC80-3、MKN45)中的表達情況。構(gòu)建RKIP真核表達載體pcDNA3.1-RKIP,并在SGC-7901細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RKIP48h后,用Western blot檢測SGC-7901細胞中RKIP蛋白表達變化;MTT檢測RKIP過表達對SGC-7901細胞活力的影響。流式細胞儀分析RKIP過表達對SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響。采用transwell侵襲小室實驗方法檢測RKIP過表達對SGC-7901細胞遷移的影響。利用熒光報告酶系統(tǒng)檢驗RKIP是miR-224調(diào)控靶基因,并采用Western blot方法檢測miR-224對細胞中RKIP蛋白表達的影響。利用MTT,流式細胞儀和transwell侵襲小室檢測miR-224對RKIP生物學(xué)特性的調(diào)控作用。結(jié)果：定量實時PCR顯示：RKIP在胃癌細胞系較正常胃粘膜上皮細胞系中的表達呈下降趨勢(p0.01).在SGC-7901中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RKIP 48h后,細胞中RKIP的表達與對照組相比顯著上升(p0.01)。MTT,流式細胞儀和transwell侵襲小室檢測結(jié)果顯示：在SGC-7901細胞中過表達RKIP后,細胞凋亡數(shù)增加(p0.01),細胞活力和S期細胞比例下降(p0.05),穿過transwell小室的細胞數(shù)降低(p0.05)。熒光素酶報告基因系統(tǒng)的檢測結(jié)果：與對照組相比,經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-224 mimic組的熒光素酶活力顯著降低(p0.05)。用Western blot檢測的結(jié)果顯示：與非轉(zhuǎn)染組相比,SGC-7901轉(zhuǎn)染miR-224 mimic48h后,細胞中RKIP蛋白的表達量顯著下降(p0.05)。MTT,流式細胞儀和transwell侵襲小室檢測結(jié)果顯示：在SGC-7901中轉(zhuǎn)染miR-224 mimic后,可抑制因過表達RKIP后導(dǎo)致的細胞生物學(xué)特性的改變。結(jié)論：RKIP在人胃癌細胞系表達下調(diào),miR-224可負調(diào)節(jié)RKIP蛋白的表達,進而促進腫瘤的活性,RKIP可抑制胃癌細胞的增殖和侵襲。增強RKIP表達的治療策略有望使胃癌患者受益。第二部分RKIP通過NF-KB/Snail信號通路促進順鉑誘導(dǎo)的胃癌細胞的死亡背景：胃癌化療的有效率因化療耐藥而明顯受限,多數(shù)研究者認為腫瘤細胞的凋亡程度是化療療效判定的重要指標,腫瘤細胞的凋亡與化療藥物的療效呈時間、劑量的依賴關(guān)系。2013年Martinho O等研究報道了RKIP與子宮頸癌的順鉑化療敏感性相關(guān)。順鉑是目前胃癌術(shù)后輔助化療及術(shù)前新輔助化療中最常用的藥物之一,也是目前利用體外培養(yǎng)胃癌組織進行藥敏實驗的常用藥物。研究表明順鉑可以通過結(jié)合DNA形成交聯(lián)進而抑制DNA合成,抑制細胞分裂,最終誘導(dǎo)細胞凋亡,但腫瘤細胞耐藥性的存在,極大地降低了順鉑的療效。本研究通過檢測RKIP在人胃癌細胞系SGC-7901中以及順鉑耐藥的細胞株SGC-7901/DDP中表達的情況,探討RKIP在胃癌細胞中對順鉑化療敏感性的關(guān)系以及其作用的信號通路,為胃癌的治療提供新的方法和策略。方法：分別體外培養(yǎng)人胃癌細胞系SGC-7901及順鉑的耐藥細胞株SGC-7901/DDP,用Western blot檢測RKIP蛋白在兩種細胞中表達的情況。用轉(zhuǎn)染RKIP siRNA的胃癌細胞SGC-7901,經(jīng)培養(yǎng)48h后,Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細胞中RKIP蛋白表達量的變化,用MTT檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染RKIP siRNA的胃癌細胞細胞活力的變化,以及用MTT和流式細胞儀檢測RKIP的異位表達對順鉑誘導(dǎo)的耐藥胃癌細胞活力和對細胞凋亡的影響。采用Western blot方法檢測RKIP異位表達對順鉑誘導(dǎo)的胃癌細胞中NF-κB和Snail表達的影響。結(jié)果：Western blot檢測結(jié)果表明：RKIP在順鉑耐藥細胞株SGC-7901/DDP中的表達量較胃癌細胞SGC-7901明顯下降(p0.05)。與對照組相比,在SGC-7901細胞中轉(zhuǎn)染RKIP siRNA48h后,細胞中RKIP的表達顯著下降(p0.01). MTT檢測結(jié)果顯示：在SGC-7901細胞中轉(zhuǎn)染RKIP siRNA后,細胞活力明顯上升(p0.05),在SGC-7901/DDP細胞中轉(zhuǎn)染RKIP重組表達質(zhì)粒后,細胞的活力明顯下降(p0.05)。流式細胞儀和MTT的結(jié)果顯示：胃癌細胞SGC-7901抑制RKIP表達后,即使在順鉑作用下,腫瘤細胞凋亡的數(shù)量明顯減少(p0.05),細胞的活力也明顯上升(p0.05);順鉑的耐藥細胞株SGC-7901/DDP細胞過表達RKIP后,即使在順鉑作用下,細胞的凋亡也顯著增加(p0.05),細胞的活力下降(p0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示：在SGC-7901細胞中,抑制RKIP的表達,可明顯促進NF-κB表達的升高(p0.05)；而在SGC-7901/DDP細胞中,促進RKIP的表達,可明顯抑制Snail的表達(p0.05)。結(jié)論：RKIP蛋白在SGC-7901/DDP細胞株中表達下調(diào),過表達RKIP可使胃癌細胞對順鉑的敏感性增強,其作用機制可能是通過NF-κB/Snail信號通路。第三部分RKIP通過調(diào)控1HMGA2和OPN的表達來抑制胃癌細胞的存活和遷移背景：高遷移率族蛋白A2(HMGA2),在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。Sugiko等發(fā)現(xiàn),在人類胰腺癌中,HMGA2是MEK的間接靶基因,可以與Snaill基因啟動子區(qū)域結(jié)合,抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄,從而促進了胰腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。我們前期的研究結(jié)果顯示了,RKIP在人胃癌細胞系的表達下調(diào),并可抑制胃癌細胞增殖和侵襲。關(guān)于RKIP抑制胃癌細胞增殖、侵襲和促進凋亡的機制,已有的研究顯示,HMGA2是MEK的間接靶基因,由此推斷,RKIP可能通過抑制MEK的活化來抑制HMGA2的生物學(xué)作用,從而發(fā)揮其抑制胃癌細胞增殖、侵襲和促進凋亡的生物學(xué)作用。本研究探討RKIP抑制胃癌細胞存活,侵襲和促進凋亡的機制,為RKIP應(yīng)用于胃癌治療提供理論依據(jù)。方法：構(gòu)建RKIP和HMGA2重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-RKIP和pcDNA3.1-HMGA2,利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-RKIP或RKIP-shRNA轉(zhuǎn)染進胃癌細胞系SGC-7901細胞中,實時定量PCR或Western blot檢測RKIP在SGC-7901細胞中異位表達后,細胞中RKIP、HMGA2和OPN mRNA和蛋白表達變化。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HMGA2或HMGA2-shRNA轉(zhuǎn)染進胃癌細胞系SGC-7901細胞后,Western blot檢測HMGA2在SGC-7901細胞中表達變化。并利用流式細胞儀和transwell分析法檢測,在胃癌細胞SGC-7901中異位表達HMGA2后,HMGA2對SGC-7901細胞的增殖、凋亡和侵襲的影響。為了進一步探討RKIP對HMGA2生物活性的調(diào)控作用,在SGC-7901細胞中同時過表達RKIP和HMGA2,或同時干擾RKIP和HMGA2,并利用流式細胞儀和transwell分析法檢測其對SGC-7901細胞增殖、凋亡和侵襲的影響。結(jié)果：實時定量PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示：在SGC-7901細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RKIP后,RKIP mRNA和蛋白表達顯著增高(p0.01),而HMGA2和OPN mRNA和蛋白表達則顯著降低p0.01)；而在SGC-7901細胞中轉(zhuǎn)染RKIP-shRNA后,結(jié)果則相反。在SGC-7901細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMGA2后,細胞中HMGA2蛋白表達顯著增高(p0.01),而細胞中轉(zhuǎn)染HMGA2-shRNA后,HMGA2蛋白表達顯著降低(p0.01)。流式細胞儀和transwell分析結(jié)果顯示：在SGC-7901細胞中,過表達HMGA2后,細胞(G2+S)比例[(G2+S) phase fraction]顯著升高(p0.01),凋亡細胞比例明顯降低(p0.05),侵襲細胞數(shù)明顯增多(p0.05)；而干擾HMGA2表達后,以上結(jié)果則相反。在SGC-7901細胞中同時過表達RKIP和HMGA2,或同時干擾RKIP和HMGA2,同時過表達或同時干擾組的細胞(G2+S)比例、凋亡細胞比例和侵襲細胞數(shù),與對照組相比,差異不顯著(p0.05)。結(jié)論：RKIP可能通過其調(diào)節(jié)HMGA2或OPN的表達抑制胃癌細胞的生物學(xué)活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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本文編號：1709378