本文選題：結(jié)直腸癌　切入點(diǎn)：氯化兩面針堿　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是西方國家一個(gè)嚴(yán)重的健康問題,是發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家發(fā)病率排名第三的腫瘤。男性結(jié)直腸癌發(fā)病率排在肺癌和前列腺腫瘤之后,其高發(fā)年齡是50-65歲。結(jié)直腸癌在女性僅次于乳腺癌,占據(jù)第二位的發(fā)生率。全世界每年大約有一百萬新發(fā)病例,約有550000男性和470000女性,這表明結(jié)直腸癌正在成為一個(gè)越來越重要的公共衛(wèi)生問題。結(jié)直腸癌約占所有腫瘤的13%,與許多其他癌癥相似,在發(fā)展中地區(qū)和發(fā)達(dá)地區(qū)表現(xiàn)出差異。與此同時(shí),在過去的20年中,由于外科技術(shù)的進(jìn)步,同時(shí)使用輔助化療、放療技術(shù)的提高以及一級和二級預(yù)防運(yùn)動的改進(jìn),結(jié)直腸癌的生存期有所增加并且死亡率減少。大約有50%新診斷患者會進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性癌癥,且約50—60%的可達(dá)到平均五年的生存期。一般情況下,結(jié)直腸癌確診時(shí)已到晚期,這是由于快速轉(zhuǎn)移導(dǎo)致,因此通過血液形成的高轉(zhuǎn)移率,是實(shí)現(xiàn)更有效治療的主要障礙之一。結(jié)直腸癌發(fā)病率在世界不同地區(qū)存在差異,這些地理性差異可能是由于在不同地區(qū)人群的基因遺傳和當(dāng)?shù)氐娘嬍沉?xí)慣存在不同。結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素包括：個(gè)人和家族遺傳史及環(huán)境和飲食習(xí)慣。有以下疾病的人群較一般人群發(fā)病率高2-3倍,如腸道的良性或惡性腫瘤家族史、腺瘤、女性45歲之前罹患癌癥如卵巢、子宮和乳房癌癥。值得注意的是至少15%的結(jié)直腸癌有家族聚集現(xiàn)象。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)理以及腫瘤進(jìn)展過程中涉及的分子較為復(fù)雜,這是由于調(diào)控上皮細(xì)胞進(jìn)展和細(xì)胞分化的基因突變累積的結(jié)果。結(jié)直腸癌根據(jù)起源和表現(xiàn)形式的不同可以分為以下三種類型：(1)散發(fā)類型,指不存在基因突變但存在易感性,不顯示出任何家族遺傳性。60-80%的結(jié)直腸癌,是散發(fā)類型。(2)家族聚集類型,沒有相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn),約占20-40%的病例。人口研究表明,存在散發(fā)型結(jié)腸癌有血緣關(guān)系的家庭成員時(shí),結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是普通人群的兩到三倍。(3)遺傳類型,腺瘤息肉的存在與否可以區(qū)分兩種腫瘤變異的傾向。1)家族性腺瘤息肉病(FAP)患者存在多個(gè)息肉,若不進(jìn)行預(yù)防性手術(shù),在40歲時(shí),一個(gè)或多個(gè)腺瘤可能成為惡性腫瘤；2)遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(HNPCC),是一種惡性腫瘤,發(fā)展為非消化道癌癥的風(fēng)險(xiǎn)非常高。近來,天然中草藥物副作用小,用于治療包括癌癥在內(nèi)的各類疾病,正成為一種新型抗癌藥物而備受關(guān)注。因此,新天然藥物的出現(xiàn)或許可為抗癌治療提供一個(gè)新方法。氯化兩面針堿(Nitidine Chloride, NC),是中草藥兩面針中的重要成分。研究表明,氯化兩面針堿有多種生物活性,包括抗炎、抗瘧、抗菌、止痛及抗癌癥活性,而最近研究表明氯化兩面針堿可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制人類腫瘤發(fā)生及進(jìn)展。氯化兩面針堿可抑制周期蛋白B1(Cyclin B1)和p53依賴性通路,使細(xì)胞G2/M期阻滯,進(jìn)而抑制多種癌細(xì)胞的生長。另有研究發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可通過調(diào)控JAK1/STAT3信號途徑抑制肝腫瘤細(xì)胞生長。此外,氯化兩面針堿可以通過c-Src/FAK相關(guān)通路抑制肝癌細(xì)胞和腎癌細(xì)胞的增生以及乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。多方面證據(jù)表明,絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路是結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的主要調(diào)節(jié)途徑,在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。MAPK家族有三個(gè)成員：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Ras/Raf1/MEK/ERK)、c-Jun N端或應(yīng)激激活蛋白激酶(JNK或SAPK)和p38家族。許多證據(jù)表明MAPK途徑參與人類結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程,而且MAPK信號通路的抑制劑作為新的抗結(jié)直腸癌藥物,正處于臨床實(shí)驗(yàn)階段。本研究探討了氯化兩面針堿對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡；抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制主要是阻斷MAPK信號通路,同時(shí)激活了Bax、caspase等凋亡相關(guān)蛋白,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。以上結(jié)果表明,氯化兩面針堿有可能成為新的臨床化療藥物,從而為改善結(jié)直腸癌的預(yù)防及治療提供價(jià)值。研究目的1.探討氯化兩面針堿對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和增殖的影響；2.探討氯化兩面針堿對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響；3.探討氯化兩面針堿對結(jié)直腸癌細(xì)胞影響的相關(guān)機(jī)制。研究方法直腸癌細(xì)胞株采用人HCT116,MTT實(shí)驗(yàn)用來評估細(xì)胞的生存能力和增殖活性。Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)及TUNEL實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)測定分析凋亡。Western blot實(shí)驗(yàn)分析蛋白。本數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)三次。單因素方差分析被用于各組間的比較。不同組間的差異分析采用T檢驗(yàn)。當(dāng)P0.05時(shí),數(shù)據(jù)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.氯化兩面針堿(NC)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖MTT試驗(yàn)用來探討氯化兩面針堿(NC)對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用。氯化兩面針堿以時(shí)間和劑量依賴性的方式,抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步評估結(jié)果,[3H]胸苷吸收實(shí)驗(yàn)被用來檢測氯化兩面針堿對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,氯化兩面針堿(NC)在一系列濃度(5、10和20gM)范圍內(nèi)可以顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。由于氯化兩面針堿(NC)濃度達(dá)到10和20μM時(shí)的顯著影響,這些濃度(10和20μM)的NC被選擇應(yīng)用于隨后的實(shí)驗(yàn)。以上數(shù)據(jù)表明NC可有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。2.氯化兩面針堿(NC)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中ERK的磷酸化氯化兩面針堿能夠顯著抑制細(xì)胞增殖,接下來本課題組探討了氯化兩面針堿抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制。MAPK信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本課題組分別以10和20μM的NC濃度處理細(xì)胞24h后,檢測了MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明氯化兩面針堿處理細(xì)胞后,ERK磷酸化水平下降,表明氯化兩面針堿有可能作用于ERK抑制細(xì)胞增殖。3.氯化兩面針堿(NC)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡為證實(shí)氯化兩面針堿(NC)對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用,是氯化兩面針堿誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡所致,我們用氯化兩面針堿(NC)處理結(jié)直腸癌細(xì)胞24小時(shí)。然后以Annexin V-FITC/PI實(shí)驗(yàn)分析癌細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示,當(dāng)氯化兩面針堿(NC)濃度為10和20uM時(shí),可有效地增加結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。當(dāng)以10和20uM濃度的氯化兩面針堿處理24小時(shí)后,結(jié)直腸癌凋亡死亡率從6.9%±1.3%上升至34.8%±6.8%,36.9%±7.2%。TUNEL實(shí)驗(yàn)用來評估細(xì)胞凋亡中裂解的DNA碎片。我們用氯化兩面針堿(NC)處理結(jié)直腸癌細(xì)胞24小時(shí)后,將這些腫瘤細(xì)染色,并在熒光光譜顯微鏡下觀察,10和20uM濃度的氯化兩面針堿(NC)可顯著增加癌細(xì)胞凋亡。氯化兩面針堿(NC)處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后出現(xiàn)顯著的誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,證實(shí)了氯化兩面針堿的抗癌作用。4.氯化兩面針堿(NC)通過改變Bcl-2家族蛋白和激活caspase誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡既然氯化兩面針堿能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,接下來本課題組探討了氯化兩面針堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。本課題組首先檢測了氯化兩面針堿(NC)對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3和p53表達(dá)影響。Western blot結(jié)果表明,10和20μM的氯化兩面針堿(NC)處理細(xì)胞后,抗凋亡蛋白Bcl-2減低而促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加。同時(shí),激活的Caspase-9、Caspase-3和p53的表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明,氯化兩面針堿通過誘導(dǎo)Bax的表達(dá),進(jìn)而激活Caspase-9、Caspase-3口p53,促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。5.ERK抑制劑協(xié)同氯化兩面針堿促進(jìn)細(xì)胞凋亡為進(jìn)一步探討氯化兩面針堿抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,本課題組將氯化兩面針堿和ERK抑制劑U0126聯(lián)合應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖作用顯著降低,表明ERK抑制劑顯著提高氯化兩面針堿(NC)誘導(dǎo)的抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞活性的效果。觀察3H胸苷吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得出類似結(jié)論,這也證實(shí)了阻斷ERK活化可顯著提高氯化兩面針堿(NC)誘導(dǎo)的抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖效果。6.ERK抑制劑協(xié)同氯化兩面針堿促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)理既然ERK抑制劑能夠顯著增強(qiáng)氯化兩面針堿促進(jìn)細(xì)胞凋亡,接下來本課題組聯(lián)合應(yīng)用U0126和氯化兩面針堿處理細(xì)胞,檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,用U0126抑制ERK活性可使NC誘導(dǎo)的Bax、caspase-3和caspase-9表達(dá)增加,并使Bcl-2表達(dá)下調(diào),也進(jìn)一步表明NC誘導(dǎo)的凋亡可能是ERK依賴的。結(jié)論1.氯化兩面針堿可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長和增殖；2.氯化兩面針堿可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡；3.氯化兩面針堿通過抑制ERX的磷酸化來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長和增殖。創(chuàng)新性1.首次發(fā)現(xiàn)了氯化兩面針堿可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長和增殖；2.首次發(fā)現(xiàn)了氯化兩面針堿可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡；3.首次發(fā)現(xiàn)了氯化兩面針堿通過抑制ERK的磷酸化來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長和增殖.局限性1.本研究中氯化兩面針堿對結(jié)直腸癌的影響主要局限于體外實(shí)驗(yàn),未進(jìn)行相關(guān)動物模型實(shí)驗(yàn)；2.結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò),本研究僅探究了氯化兩面針堿與ERK、MAPK之間的聯(lián)系而未探究與其他信號通路之間的聯(lián)系。
[Abstract]:Colorectal cancer ( CRC ) is a serious health problem in Western countries . The incidence of colorectal cancer is the third in developed and developing countries . The incidence of colorectal cancer is 50 - 65 years after lung cancer and prostate cancer . The incidence of colorectal cancer varies from about 50 to 60 % . ( 3 ) The presence or absence of hereditary type and adenomatous polyp can distinguish the tendency of two types of tumor variation . 1 ) There are multiple polyps in familial adenomatous polyp disease ( FAP ) . If preventive operation is not performed , one or more adenomas may become malignant tumors at the age of 40 years .
2 ) hereditary non - colorectal cancer ( HNPCC ) , a kind of malignant tumor , is a very high risk for non - digestive tract cancer . Recently , there are many kinds of biological activities of the natural Chinese herbal medicine , including anti - inflammatory , anti - malaria , antibacterial , analgesic and anti - cancer activity .
The mechanism of inhibiting cell proliferation is to block MAPK signaling pathway , and activate the apoptosis - related proteins such as Bax , caspase and so on , promote apoptosis of cells .
2 . To investigate the effect of two - sided needle chloride on the apoptosis of colorectal cancer cells .
In this study , the proliferation of colorectal cancer cells was determined by MTT assay . The results showed that the proliferation of colorectal cancer cells was significantly inhibited by the use of double - needle base ( NC ) . The results showed that the two - sided needle base ( NC ) inhibited the proliferation of colorectal cancer cells .
2 . The apoptosis of colorectal cancer cells can be induced by two - sided needle chlorination .
3 . The growth and proliferation of colorectal cancer cells were inhibited by inhibiting the phosphorylation of ERX .
2 . The apoptosis of colorectal cancer cells can be induced by the first time .
3 . The growth and proliferation of colorectal cancer cells were inhibited for the first time by inhibiting the phosphorylation of ERK .
2 . The pathogenesis of colorectal cancer is a complex signal network . This study only probes into the link between the two - face needle base and ERK and MAPK , but does not explore the connection with other signal pathways .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

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本文編號：1708183