本文選題：白血病干細(xì)胞　切入點(diǎn)：急性髓細(xì)胞白血病　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的 研究認(rèn)為白血病患者體內(nèi)存在一群極微量的細(xì)胞群,這些細(xì)胞通常對(duì)化療藥物不敏感,能夠逃逸化學(xué)藥物的殺傷作用；同時(shí)具有一定的自我更新能力使其可以在體內(nèi)維持白血病的生成,從而成為白血病復(fù)發(fā)和耐藥的根源。這群白血病細(xì)胞被稱為白血病干細(xì)胞(Leukemia stem cells, LSCs)。只有有效清除LSCs,才能從根本上治愈白血病。發(fā)現(xiàn)并研究LSCs上特異性表達(dá)的分子抗原,對(duì)LSCs的生物學(xué)特性研究以及白血病治療都具有重要意義。前期實(shí)驗(yàn)初步表明,本實(shí)驗(yàn)室自行研制的3A4單克隆抗體對(duì)急性髓系白血病干細(xì)胞(CD34+CD38-CD123+)具有較強(qiáng)的識(shí)別能力。在此基礎(chǔ)上,我們對(duì)3A4單抗靶向的3A4抗原的生物學(xué)特性進(jìn)行全面和深入的分析,探討3A4抗原作為AML LSCs靶點(diǎn)的可能性,為白血病靶向治療提供新的途徑。本課題進(jìn)行了如下四個(gè)部分內(nèi)容的研究：(1)3A4抗原表達(dá)規(guī)律的分析；(2)3A4抗原表位的研究；(3)3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性的研究；(4)3A4-高三尖杉酯堿抗體偶聯(lián)物的制備及其靶向殺傷活性檢測(cè)。 方法 13A4抗原表達(dá)規(guī)律的分析 1.13A4及相關(guān)抗原在白血病干細(xì)胞及各亞群細(xì)胞上的表達(dá)：(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3A4抗原、3A4的相關(guān)同型抗原(CD45RA、CD45和CD45RO)以及干／祖細(xì)胞相關(guān)抗原(CD33、CD44、CD123、CD133、CD19和HLA-DR)在兒童白血病患者骨髓LSCs、正常造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)及各亞群細(xì)胞上的表達(dá)情況。其中ALL37例(31例B-ALL,6例T-ALL), AML54例(4例M0-M1,14例M2,5例M3,29例M4-M5,2例M6),CML6例。11例特發(fā)性血小板減少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)患者作為對(duì)照。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3A4抗原及上述抗原在10例AML和10例B-ALL復(fù)發(fā)白血病患者骨髓白血病細(xì)胞上的表達(dá)。(3)細(xì)胞定義：LSCs和HSCs以CD34+CD38-Lin-細(xì)胞群定義,各亞群細(xì)胞分別指CD34-、CD34+CD38+、 CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-細(xì)胞。 1.23A4抗原在多器官正常組織和腫瘤組織的分布情況：通過組織微陣列技術(shù)結(jié)合免疫組化法檢測(cè)3A4抗原在99例多器官正常組織和96例多器官腫瘤組織上的表達(dá)。 23A4抗原表位的研究 2.1CD45RC各截短型真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)：根據(jù)CD45基因6號(hào)外顯子基因序列(CD45RC)構(gòu)建4個(gè)不同的截短型真核表達(dá)載體,分別命名為pcDNA3.1+/CD45RC-1(包含6號(hào)外顯子前99bp)、pcDNA3.1+/CD45RC-2(包含6號(hào)外顯子后99bp)、pcDNA3.1+/CD45RC-3(包含6號(hào)外顯子前48bp)和pcDNA3.1+/CD45RC-4(包含6號(hào)外顯子后48bp)；將空載體pcDNA3.1+、未截短型pcDNA3.1+/CD45RC以及構(gòu)建成功的上述4個(gè)截短型真核表達(dá)載體分別經(jīng)轉(zhuǎn)染級(jí)抽提試劑盒抽提質(zhì)粒后,經(jīng)LipofectamineTM2000試劑盒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將上述質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞；通過RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞目的基因的表達(dá)；采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞膜上的CD45RC各截短體蛋白的表達(dá)情況。 2.2表位肽掃描法測(cè)定3A4抗原表位：根據(jù)CD45基因6號(hào)外顯子編碼的氨基酸序列采用固相合成法合成一條多肽片段(序列為DVPGERSTAS TFPTDPVSPL TTTLSLAHHS SAALPARTSN TTITANTSD);采用質(zhì)譜法(Mass spectrometry, MS)及高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)合成的多肽抗原的正確性及純度；根據(jù)間接酶聯(lián)免疫吸附分析法(Indirect enzyme linked immunosorbent assay, iELISA)分析該抗原多肽與3A4抗體的結(jié)合能力。 33A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性研究 3.1體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性：間接免疫磁珠法分選3A4陽性和3A4陰性Kasumi細(xì)胞和HL60細(xì)胞；BrdU滲入法標(biāo)記3A4陽性和3A4陰性白血病細(xì)胞的增殖狀態(tài)；CCK-8法和Annexin V-PI染色法檢測(cè)化療藥物作用下3A4陽性和3A4陰性白血病細(xì)胞的增殖狀態(tài)和抗凋亡能力。 3.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性：通過3A4抗體封閉白血病細(xì)胞株(KGla細(xì)胞和Nalm-6細(xì)胞)和人骨髓單個(gè)核細(xì)胞表面的3A4抗原,觀察經(jīng)過3A4抗體封閉和未封閉的兩群細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤能力的差異；通過間接免疫磁珠法分選3A4陽性和3A4陰性的AML患者骨髓單個(gè)核白血病細(xì)胞,比較這兩群細(xì)胞在NOD/SCID小鼠異體移植成瘤能力的差異。 43A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物的制備及靶向殺傷活性檢測(cè)： 4.13A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物的制備：異型雙功能交聯(lián)劑(SPDP和SMCC)修飾3A4抗體的半胱氨酸(Cysteine, Cys)富含的巰基(-SH)或賴氨酸(Lysine, Lys)殘基富含的氨基(-NH2)；硫脲法將高三尖杉酯堿(Homoharringtonine, HHT)的末端羥基(-OH)巰基化；修飾后的3A4抗體與巰基化HHT4℃過夜結(jié)合反應(yīng)：BCA測(cè)定3A4-HHT偶聯(lián)藥物蛋白濃度；流式細(xì)胞儀測(cè)定3A4-HHT偶聯(lián)藥物的活性。 4.23A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物靶向殺傷活性檢測(cè)：采用CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度(0、1、2、4、8、16、32μg/ml)3A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物在不同作用時(shí)間(24h、48h和72h)下對(duì)KG1a細(xì)胞和Nalm-6細(xì)胞的靶向殺傷活性。 結(jié)果 13A4抗原表達(dá)規(guī)律的分析 1.13A4及相關(guān)抗原在白血病干細(xì)胞及各亞群細(xì)胞上的表達(dá)：(1)3A4抗原在AML LSCs上的表達(dá)水平明顯高于HSCs,中位表達(dá)水平分別為94.8%vS.21.8%,P0.0001；且3A4抗原在54例AML患者的LSCs上均為陽性表達(dá)。(2)3A4抗原在AML和B-ALL復(fù)發(fā)白血病患者的白血病細(xì)胞上具有較強(qiáng)的表達(dá),中位表達(dá)水平分別為(90.94±4.9)%和(81.74±9.1)%。(3)3A4抗原在各亞型AML LSCs上的表達(dá)水平分別為(92.3±3.3)%[M0-1]、(95.1±1.5)%[M2]、(46.4±13.8)%[M3]、(85.2±4.3)%[M4-5]和(61.2士28.9)%[M6],以MO-1和M2型白血病上的抗原表達(dá)水平最高。(4)3A4抗原在正常CD34+CD38+細(xì)胞上較其他細(xì)胞亞群(CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-)相對(duì)高表達(dá),而在AML CD34+CD38+、CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-各細(xì)胞群上的表達(dá)無明顯差異。(5)3A4抗原在AML LSCs和HSCs上的表達(dá)選擇性明顯高于CD33、CD123、CD133、CD44和HLA-DR抗原。 1.23A4抗原在多器官正常組織和腫瘤組織器官的分布情況：(1)3A4抗原主要在脾臟、扁桃體和胸腺等淋巴組織器官上表達(dá),在甲狀旁腺、小腸、結(jié)腸、胃等組織上主要限制表達(dá)于淋巴組織處,在重要器官組織(如腦、心、肝、肺、腎、生殖器官)上基本不表達(dá)。(2)3A4抗原主要在腸、脾、甲狀腺、淋巴結(jié)等淋巴組織處發(fā)生的B細(xì)胞性淋巴瘤、B細(xì)胞性細(xì)胞瘤、何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤上高表達(dá),在T細(xì)胞性淋巴瘤上基本不表達(dá)。 23A4抗原表位的研究 2.1CD45RC各截短型真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)：(1)真核表達(dá)載體pcDNA3.1+/CD45RC-1、pcDNA3.1+/CD45RC-2、pcDNA3.1+/CD45RC-3和pcDNA3.1+/CD45RC-4經(jīng)搖菌擴(kuò)增提取質(zhì)粒DNA后,酶切及測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建的載體分別包含相應(yīng)的目的基因片段,表明CD45RC的4個(gè)截短型真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。(2)RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的各截短型CD45RC CHO細(xì)胞中存在CD45基因表達(dá),表明各轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上成功表達(dá)CD45基因,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別命名為CD45RC-1CHO、CD45RC-2CHO、CD45RC-3CHO和CD45RC-4CHOO(3)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn),4個(gè)截短型CD45RC CHO細(xì)胞均可檢測(cè)到3A4抗原的表達(dá),表達(dá)水平分別為(36.7+6.9)%、(35.2+13.3)%、(43±7.9)%和(41.4+14.2)%,各組間均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均0.05)。而Western blot法在CD45RC-1CHO、CD45RC-2CHO、CD45RC-3CHO和CD45RC-4CHO細(xì)胞上未能檢測(cè)到3A4抗體識(shí)別的抗原。 2.2表位肽掃描法測(cè)定3A4抗原表位：MS結(jié)果顯示合成的多肽抗原分子量為4996.5,與理論分子量4996.35相近,從分子量水平上提示多肽合成正確；HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示,合成的多肽抗原純度為70%左右,符合下一步實(shí)驗(yàn)要求；iELISA結(jié)果顯示,3A4抗體不能識(shí)別CD45基因6號(hào)外顯子編碼的氨基酸線性序列,提示3A4抗原表位可能為構(gòu)象型表位。 33A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性研究 3.1體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性：3A4陽性Kasumi細(xì)胞和HL60細(xì)胞的增殖能力分別低于相應(yīng)3A4陰性Kasumi細(xì)胞和HL60細(xì)胞的增殖能力,BrdU的表達(dá)水平分別為(4.6±1.9)%vs.I(35.1+1)%,(P0.05)和(44.9士1.3)%vs.(74.4±2)%,(P0.05); IC50和IC70作用濃度下的THP和Ara-C對(duì)3A4陽性Kasumi細(xì)胞和HL60細(xì)胞的抑制率均低于相應(yīng)3A4陰性細(xì)胞(P值均0.05),而IC50和IC70濃度下的HHT對(duì)這兩群細(xì)胞的抑制率均無明顯差異(P值均0.05)；在THP和Ara-C作用下,3A4陽性Kasumi細(xì)胞和HL60細(xì)胞的抗凋亡能力均高于相應(yīng)的3A4陰性白血病細(xì)胞,而在HHT作用下兩者的抗凋亡能力無明顯差異。 3.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性：經(jīng)尾靜脈注射5×106個(gè)Nalm-6細(xì)胞后,3A4抗體孵育組小鼠和鼠IgG抗體孵育組小鼠在植入15天以后,均開始出現(xiàn)行動(dòng)遲緩,消瘦、后肢癱瘓或弓背等情況,流式和病理結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)存在白血病細(xì)胞浸潤(rùn),中位發(fā)病時(shí)間分別為18和22天。經(jīng)尾靜脈注射5×106個(gè)KGla細(xì)胞后,鼠IgG抗體孵育組小鼠均生成白血病,成瘤率為100%(3/3),中位發(fā)病時(shí)間為58天；3A4抗體孵育組小鼠生存狀態(tài)良好。 43A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物的制備及靶向殺傷活性檢測(cè)：BCA測(cè)定3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT偶聯(lián)物的蛋白濃度分別為0.2mg/ml和0.3mg/ml;流式結(jié)果顯示3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT對(duì)KGla細(xì)胞的識(shí)別能力與裸抗3A4無明顯差異,分別為98.89%和94.68%；CCK-8結(jié)果顯示,在不同觀察時(shí)間和藥物濃度作用下,3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT對(duì)Nalm-6細(xì)胞的抑制率均明顯低于KGla細(xì)胞(P值均0.05),說明3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT對(duì)靶細(xì)胞KGla具有良好的選擇性殺傷作用。其中,3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT隨著作用濃度增加,對(duì)細(xì)胞的抑制作用亦逐漸增強(qiáng),但不呈時(shí)間依賴性。 結(jié)論 1.3A4抗原選擇性地高表達(dá)于AML LSCs,以M0-1和M2類型白血病最為明顯,而在正常HSCs上弱表達(dá)。3A4抗原在AML LSCs和HSCs上的表達(dá)選擇性明顯高于CD33、CD123、CD133和CD44等抗原分子。此外在復(fù)發(fā)AML患者的骨髓白血病幼稚細(xì)胞上同樣具有較強(qiáng)的表達(dá)水平。 2.3A4抗原主要在淋巴相關(guān)組織器官及淋巴細(xì)胞上表達(dá),在重要器官組織(如腦、心、肝、肺、腎和生殖器官等)上基本不表達(dá)。 3.3A4抗原表位主要為CD45基因6號(hào)外顯子編碼的蛋白區(qū)域,可能是構(gòu)象型表位。 4.3A4抗原陽性的HL60細(xì)胞和Kasumi細(xì)胞較相應(yīng)的3A4陰性細(xì)胞耐藥及抗凋亡能力更強(qiáng),一定程度上反映了3A4陽性白血病干細(xì)胞的特性。 5.3A4抗體可以有效抑帶KG1a細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤。 6.成功制備3A4-SMCC-HHT和3A4-SPDP-HHT抗體偶聯(lián)物,體外顯示良好的靶向殺傷效應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.71

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本文編號(hào)：1701956