本文選題：宮頸癌　切入點：micro　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：宮頸癌(cervical cancer)是一種常見的女性生殖道惡性腫瘤,具有較高的發(fā)病率和死亡率。手術(shù)結(jié)合放化療是目前宮頸癌的綜合治療模式,但對于晚期患者已失去手術(shù)機會,而放化療對機體正常組織的損傷使一些患者無法耐受�；蛑委熆赏瑫r阻斷多個癌基因的表達,效果顯著,且具有許多傳統(tǒng)方法無法比擬的特點和優(yōu)勢,可作為手術(shù)和放化療的補充,為宮頸癌的治療開辟了一條新的途徑。叉頭框蛋白(forkhead box protein,FOX)是一類轉(zhuǎn)錄因子,共分為19個亞家族,分別被命名為FOXA~S,其中O亞家族(FOXO)是研究最為深入的一類。人FOXO亞家族有4個成員,即FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6,其中FOXO1蛋白廣泛表達于幾乎所有組織,調(diào)控著細胞調(diào)亡及抗氧化應(yīng)激等過程,是一種重要的腫瘤抑制因子。有研究表明,微RNA(micro RNA,mi RNA)作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,可調(diào)控FOXO1基因的表達,參與細胞分化、增殖、凋亡等諸多生物學(xué)過程,提示mi RNA可能作為癌基因或抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。mi RNA是高等真核生物中的一類長約20~23個核苷酸的小分子單鏈RNA,大量研究證實,腫瘤組織和正常組織中的mi RNA表達譜存在顯著差異。micro RNA-135b(mi R-135b)最早發(fā)現(xiàn)于鼠,隨后被證實在脊椎動物中廣泛存在。mi R-135b編碼基因為MIRN135B,定位于1q32.1,其前體由70個核苷酸組成,在胞質(zhì)中經(jīng)Dicer酶剪切生成長約21~24個核苷酸的成熟序列。目前已有研究表明mi R-135b與多種腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等有關(guān),但mi R-135b在宮頸癌中相關(guān)的生物學(xué)作用尚未見報道。本研究通過檢測mi R-135b在宮頸癌細胞系中的表達、mi R-135b在宮頸癌細胞增殖中的作用、mi R-135b在宮頸癌細胞凋亡中的作用、mi R-135b在宮頸癌細胞遷移、侵襲中的作用、mi R-135b對宮頸癌細胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移作用的分子機制等五部分內(nèi)容的研究,探討mi R-135b對宮頸癌細胞生物學(xué)功能的影響及其機制,彌補了mi R-135b在宮頸癌生物學(xué)功能研究領(lǐng)域的空白,可能成為宮頸癌基因治療的一個新的靶點,為晚期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者帶來希望。目的:探討mi R-135b對宮頸癌細胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)功能的影響,并對其影響的機制進行研究,為宮頸癌的治療開辟一條新的途徑。方法:1、通過實時熒光定量PCR方法檢測mi R-135b在六種宮頸癌細胞系(C33A、HCC94、He La、HT-3、Si Ha、Ca SKi)及正常宮頸上皮細胞系(End1/E6E7)中表達的差異。2、通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù),將mi R-135b抑制物(anti-mi R-135b)轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞,同時轉(zhuǎn)染無意義對照序列(anti-mi R-NC)作為陰性對照,空白對照組細胞不做任何處理。采用MTT法檢測細胞活性;Brd U-ELISA技術(shù)檢測細胞增殖情況;流式細胞術(shù)檢測細胞周期的變化;實時熒光定量PCR及western blot檢測細胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白(p21、p27及cyclin D1)m RNA及蛋白的表達變化。3、將anti-mi R-135b或anti-mi R-NC轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞,通過Hoechst 33258染色法及流式細胞術(shù)(Annexin V/PI染色法)檢測細胞凋亡情況;western bolt檢測細胞色素C的釋放;Western blot檢測cleaved caspase-3,8,9及Bax/Bcl-2蛋白的表達情況;JC-1染色檢測線粒體膜電位變化。4、將anti-mi R-135b或anti-mi R-NC轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞,利用transwell侵襲實驗觀察mi R-135b對宮頸癌細胞侵襲能力的影響;劃痕實驗觀察mi R-135b對宮頸癌細胞遷移能力的影響;western blot檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達變化。5、在mi R-135b對宮頸癌細胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移作用分子機制的研究中,首先通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測mi R-135b作用的靶基因,將anti-mi R-135b或anti-mi R-NC轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞,采用實時熒光定量PCR及western blot分別檢測靶基因m RNA及蛋白的表達,進一步驗證靶基因,并通過雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)尋找對靶基因作用的位點;其次構(gòu)建靶基因si RNA(實驗組)及相應(yīng)的對照序列si RNA-control(對照組),分別與anti-mi R-135b共轉(zhuǎn)染細胞,通過Brdu-ELISA檢測細胞的增殖情況,實時熒光定量PCR及western blot分別檢測p21、p27及cyclin D1的m RNA及蛋白表達水平;采用western blot檢測cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9及Bax/Bcl-2的表達;利用westernblot檢測細胞中細胞色素C的釋放情況;通過western blot檢測MMP-2及MMP-9的表達情況。結(jié)果:1、mi R-135b在宮頸癌細胞系中的表達與人正常宮頸上皮細胞系相比,mi R-135b在六種宮頸癌細胞系中表達均上調(diào),尤其在Si Ha細胞及HT-3細胞中表達明顯增多。2、mi R-135b在宮頸癌細胞增殖中的作用(1)與轉(zhuǎn)染anti-mi R-NC組相比,轉(zhuǎn)染anti-mi R-135b組細胞活性明顯減弱;(2)與轉(zhuǎn)染anti-mi R-NC組相比,轉(zhuǎn)染anti-mi R-135b組細胞增殖能力明顯降低;(3)與轉(zhuǎn)染anti-mi R-NC組相比,當(dāng)轉(zhuǎn)染anti-mi R-135b的濃度達15n M時,即可對細胞周期產(chǎn)生明顯影響,使G0/G1期細胞百分比明顯增多,而S期細胞百分比顯著減少;(4)與轉(zhuǎn)染anti-mi R-NC組相比,轉(zhuǎn)染anti-mi R-135b組p21、p27的m RNA及蛋白表達水平均明顯升高,而cyclin D1的m RNA及蛋白表達水平明顯減少。3、mi R-135b在宮頸癌細胞凋亡中的作用(1)與轉(zhuǎn)染anti-mi R-NC組相比,轉(zhuǎn)染anti-mi R-135b組凋亡細胞明顯增加,且隨著anti-mi R-135b濃度升高,細胞凋亡數(shù)量增加,呈濃度依賴性;(2)抑制mi R-135b促進細胞色素C從線粒體釋放入胞漿,且隨著anti-mi R-135b濃度增加,線粒體內(nèi)的細胞色素C含量呈下降趨勢,而胞漿內(nèi)細胞色素C的含量呈上升趨勢;(3)抑制mi R-135b后,減少了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,增加了促凋亡蛋白Bax的表達,Bax/Bcl-2比率增高;細胞內(nèi)可以檢測到活化形式的Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8及Cleaved caspase-9表達,且隨anti-mi R-135b濃度升高,Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8及Cleaved caspase-9表達量增加;(4)隨著anti-mi R-135b增加,綠色熒光比例逐漸升高,即JC-1以單體形式存在的比例升高,線粒體膜電位下降。4、mi R-135b在宮頸癌細胞遷移、侵襲中的作用(1)與轉(zhuǎn)染anti-mi R-NC組相比,轉(zhuǎn)染anti-mi R-135b組的相對細胞轉(zhuǎn)移量明顯減少;(2)轉(zhuǎn)染anti-mi R-135b組12小時、24小時及48小時劃痕的寬度與相應(yīng)時間的anti-mi R-NC組相比均增寬,細胞遷移率均明顯下降,且轉(zhuǎn)染anti-mi R-135b濃度越大,細胞遷移率越低;(3)抑制mi R-135b后,MMP-2及MMP-9表達減少,且呈濃度依賴性。5、mi R-135b對宮頸癌細胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移作用的分子機制研究(1)根據(jù)micro RNA作用靶點預(yù)測軟件Target Scan,發(fā)現(xiàn)FOXO1的3’UTR有與mi R-135b潛在的結(jié)合位點,預(yù)測FOXO1可能為mi R-135b的作用靶基因;(2)轉(zhuǎn)染anti-mi R-135b后,細胞內(nèi)FOXO1的m RNA及蛋白表達均明顯增多;(3)p Mir-FOXO1-3’UTRWT野生型組中,與轉(zhuǎn)染anti-mi R-NC組相比,轉(zhuǎn)染anti-mi R-135b組熒光素酶活性比率明顯升高;而在p Mir-FOXO1-3’UTR MUT突變型組中,anti-mi R-NC組與anti-mi R-135b組的熒光素酶活性比率無明顯差異;(4)與對照組相比,實驗組細胞增殖能力增強,p21、p27的m RNA及蛋白表達水平下調(diào),而cyclin D1的m RNA及蛋白表達水平上調(diào);實驗組cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9的相對表達量較對照組均明顯減少;實驗組Bax蛋白的相對表達量較對照組明顯減少,Bcl-2蛋白的相對表達量較對照組明顯增多;實驗組線粒體內(nèi)細胞色素C的相對表達量較對照組明顯增多,胞漿內(nèi)細胞色素C的相對表達量較對照組明顯減少;實驗組MMP-2及MMP-9的相對表達量較對照組均明顯增多。結(jié)論:本研究表明FOXO1為mi R-135b作用的靶基因,且其作用靶點位于FOXO1的3’UTR。mi R-135b是通過靶向FOXO1基因參與對宮頸癌細胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控。下調(diào)mi R-135b后,解除了對FOXO1的抑制,從而抑制了宮頸癌細胞增殖,誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡,降低了宮頸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,說明mi R-135b在宮頸癌發(fā)展過程中起到致癌基因的作用,可能成為宮頸癌基因治療的一個新的靶點。
[Abstract]:Cervical cancer is a kind of common female reproductive tract malignant tumor , with higher morbidity and mortality . The combination of chemotherapy and chemotherapy is one of the most important factors in the development of cervical cancer . In this study , the effects of mi R ~ ( R ) on cervical cancer cell proliferation , apoptosis and invasion and metastasis of cervical cancer cells were investigated by means of real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . The expression of MMP - 2 and MMP - 9 in cervical cancer cells was detected by Western blot , and the expression of MMP - 2 and MMP - 9 was detected by Western blot . The expression of MMP - 2 and MMP - 9 was detected by Western blot . ( 2 ) Compared with anti - mi R - NC group , the expression level of anti - mi R - 15cells transfected with anti - mi R - group was significantly decreased . ( 3 ) The expression of MMP - 2 and MMP - 9 in cervical cancer cells was significantly decreased . In the experimental group , the relative expression of Bcl - 2 and MMP - 9 was significantly decreased , and the relative expression of Bcl - 2 and MMP - 9 in the experimental group was significantly decreased than that of the control group .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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本文編號：1700895