本文選題：加味桂枝烏苓湯　切入點：溫陽補土　出處：《廣州中醫(yī)藥大學》2017年博士論文

【摘要】：研究目的:通過文獻研究論述溫陽補土活血法治療惡性膠質瘤的機理,確立以溫陽補土活血為治法,擬定加味桂枝烏苓湯,對Ⅱ-Ⅳ級膠質瘤術后患者和C6膠質瘤細胞進行研究。觀察加味桂枝烏苓湯改善惡性膠質瘤患者術后的臨床療效,通過臨床數(shù)據(jù)客觀評價溫陽補土活血法改善惡性膠質瘤患者術后的卡氏評分、生存質量、中醫(yī)癥候、血液流變學及免疫指標等方面的意義與價值。并通過體外實驗研究加味桂枝烏苓湯含藥血清抑制C6膠質瘤細胞增殖的機制,從JAK2/STAT3信號通路探討加味桂枝烏苓湯抑制C6膠質瘤細胞增殖,促進凋亡的分子機制。以探討加味桂枝烏苓湯對惡性膠質瘤患者的治療作用,為該方臨床應用于惡性膠質瘤患者提供科學依據(jù)。研究方法:一、臨床研究方法:依據(jù)納入、排除標準篩選2015年1月起至2017年1月在我院住院的惡性膠質瘤患者50例,最終納入47例,將患者隨機分為治療組和對照組,分別觀察記錄患者的卡氏評分、生存質量評分、中醫(yī)癥候評分、血液流變學指標、免疫學指標、血常規(guī)、肝腎功能等變化。二、實驗研究方法:(一)血清提取:健康SD大鼠20只,體重200±20 g,雄性,隨機分為空白組和含藥血清組。大鼠等效給藥量按人和動物體表面積折算,每日分2次灌胃中藥湯劑,首次灌胃前禁食12h,連續(xù)灌胃3天,末次灌胃前禁食12h。最后一次給藥1h后,從腹主動脈取血,處死老鼠。分離過濾血清,以DEME完全培養(yǎng)基將含藥血清或空白血清稀釋成不同濃度(即5%,10%,15%,20%,30%),分裝保存。(二)細胞培養(yǎng):復蘇C6膠質瘤細胞系,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將其于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1天進行傳代,取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。(三)CCK-8法檢測細胞生存率:取對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化后混懸,細胞計數(shù)板計數(shù)后,接種于96孔板,每孔1OOul,含105個細胞。待細胞貼壁后,將細胞培養(yǎng)液更換為不同濃度的加味桂枝烏苓湯溶液和不同濃度的空白血清對照溶液,各實驗組加味桂枝烏苓湯濃度為5%、10%、15%、20%、30%,每組6個復孔,置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于12h、24h、48h、72h培養(yǎng),更換為DMEM培養(yǎng)基,同時每孔加入10ulCCK-8溶液,恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5h,用全自動酶標儀在波長450nm處讀取各孔光密度(OD)值。實驗重復三次,算其平均值,計算細胞抑制率,繪制生長抑制曲線圖,并作統(tǒng)計學分析。(四)Western Blot法檢測:不同濃度的加味桂枝烏苓湯(5%、10%、20%)、非含藥血清(5%、10%、20%)及胎牛血清,處理細細胞48小時,收集各組細胞核蛋白。按每泳道50ug蛋白質上樣,經(jīng)8%的SDS-PA分離電泳蛋白質,濕轉致PVDF膜,5%BSA封閉,敷一抗4℃過夜,洗膜幾次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1小時,用ECL發(fā)光液可視化蛋白質條帶,并行X線膠片曝光,采用ImageJ軟件對結果進行灰度分析研究結果:一、臨床觀察結果:(一)基線分析:兩組性別基線、年齡基線、腫瘤級別基線和治療前卡氏評分、生存質量評分、中醫(yī)癥候評分、血液流變學指標、免疫學指標等基線比較。統(tǒng)計結果表明基線分析無統(tǒng)計學意義(p0.05)。(二)療效評價:1、經(jīng)獨立樣本t檢驗,治療組治療后卡氏評分、生存質量評分及中醫(yī)癥候評分與對照組比較(p0.05),差異有統(tǒng)計學意義,說明治療組的療效優(yōu)于對照組。經(jīng)配對樣本t檢驗,治療組的卡氏評分、生存質量評分、中醫(yī)癥候評分治療前后比較(p0.01),差異有顯著統(tǒng)計學意義,說明經(jīng)加味桂枝烏苓湯治療后患者的卡氏評分、生存質量評分及中醫(yī)癥候逐漸明顯改善。2、卡氏評分的改善率治療組和對照組分別為52.1%、20.8%;生存質量有效率分別為82.6%、62.5%,中醫(yī)癥候的緩解率分別為87%、58.3%。3、經(jīng)重復測量方差分析,治療組Th細胞比例在治療前、治療1周及治療2周的改變與對照組比較(p0.05),差異有統(tǒng)計學有意義。治療組Ts細胞比例在治療前、治療1周及治療2周的改變與對照組比較(p0.01),差異有顯著統(tǒng)計學意義,說明治療組在改善Th細胞、Ts細胞比例方面優(yōu)于對照組。經(jīng)重復測量方差分析,治療組Th細胞比例在治療前、治療1周及治療2周的改變比較(p0.01),差異有顯著統(tǒng)計學意義;對照組(p0.05),差異有統(tǒng)計學意義。治療組Ts細胞比例在治療前、治療1周及治療2周改變比較(p0.01),差異有顯著統(tǒng)計學意義;對照組(p0.05),無統(tǒng)計學意義。說明在兩周內(nèi)治療組在Th、Ts細胞比例方面,有逐漸改善的趨勢;對照組2周內(nèi)對Th細胞比例有改善,對Ts細胞比例無改善。4、經(jīng)重復測量方差分析,治療組的紅細胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原、血沉方程K值、血漿粘度改變在治療前、治療1周、治療2周與對照組比較(p0.01),差異有顯著統(tǒng)計學意義;說明治療組在治療1周、治療2周后的血液流變學指標明顯改善優(yōu)于對照組。經(jīng)重復測量方差分析,治療照組紅細胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原、血沉方程K值、血漿粘度在治療前、治療1周及治療2周的改變比較(p0.05),差異有統(tǒng)計學意義,說明經(jīng)治療2周后,血液流變學指標有逐漸改善的趨勢。5、安全性比較:生化指標方面,試驗過程中治療組和對照組的血常規(guī)、及肝腎功能等指標在治療1周、治療2周后均未見明顯異常,提示無明顯各臟腑功能異常。不良反應方面,治療組1例在治療第6天出現(xiàn)厭食、腹脹,未經(jīng)處理自愈,對照組中有3例出現(xiàn)頭暈、心慌、皮疹等反應。二、實驗研究結果(一)處理12h后5%、10%、15%、20%、30%濃度加味桂枝烏苓湯含藥血清對C6膠質瘤細胞的抑制率分別為4.7%、9.6%、11.7%、13.5%、4.9%;作用24h的抑制率分別為 8.9%、12.1%、12.9%、14.8%,1.8%;作用 48h 的抑制率為 13.7%、16.1%、17.5%、19%、1.4%;作用 72h 的抑制率為 13.5%、15.5%、17%、18.5%、-1.7%。說明C6膠質瘤細胞經(jīng)20%的加味桂枝烏苓湯含藥血清處理48小時時,抑制率最好。(二)倒置顯微鏡觀察細胞整體形態(tài)學改變:20%的空白血清組處理C6膠質細胞48小時后,顯微鏡下觀察可見,細胞呈不規(guī)則梭形,突觸多,折光度好,胞漿豐富,邊緣清晰而且較飽滿,培養(yǎng)皿黏合緊密。而濃度20%的含藥血清組處理48小時后,多數(shù)細胞皺縮,細胞突起變短、消失,細胞大小不一,邊緣毛刺。形態(tài)學改變提示加味桂枝烏苓湯有誘導C6膠質瘤細胞凋亡的作用。(三)加味桂枝烏苓湯處理48小時后,相同濃度含藥血清處理后的JAK2/α-actin、P-STAT3/STAT3、Survivin/β-actin與對照組相比(p0.01),差異有顯著統(tǒng)計學意義;而含藥血清處理組,經(jīng)方差分析,5%、10%、20%濃度所得結果之間相互比較(p0.01),差異有顯著統(tǒng)計學意義。結論:臨床觀察:通過本課題的臨床觀察研究,溫陽補土活血法在改善惡性膠質瘤患者術后卡氏評分、生存質量,中醫(yī)癥候、提高患者免疫功能、改善患者血液流變狀態(tài)等方面有良好的效果,值得進一步深入研究。試驗研究:加味桂枝烏苓湯通過JAK2/STAT3信號通路抑制C6膠質瘤細胞的增殖及誘導其凋亡,此發(fā)現(xiàn)為加味桂枝烏苓湯在治療膠質瘤的臨床藥物研究方面提供了一定的基礎實驗依據(jù)。
[Abstract]:The purpose of this study was to study the mechanism of treatment of malignant glioma by warming yang and invigorating the blood circulation , and to study the effect of Jiawei Guizhi Wuling Decoction on the patients with malignant glioma . The cells were cultured in DMEM medium containing 10 % fetal bovine serum at 37 鈩，

本文編號：1700600