本文選題：胃癌　切入點(diǎn)：miR-125a-5p　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：一,研究背景在我國(guó),胃癌(Gastric Cancer,GC)在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率均居首位。胃癌的發(fā)生及發(fā)展受到多因素的影響,預(yù)后差。因此,研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,開辟新的胃癌早期診斷指標(biāo)和潛在治療靶點(diǎn),對(duì)治療胃癌具有極重要的意義。microRNAs是一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)microRNAs參與多種信號(hào)調(diào)節(jié)通路,它們調(diào)控的靶基因關(guān)系著腫瘤的分化、增殖、凋亡、侵襲、遷移和血管新生等各方面。血管新生為腫瘤發(fā)展必不可少的環(huán)節(jié),大量研究證明,miRNA參與了腫瘤血管新生的過程,在腫瘤的血管新生中扮演重要角色。miR-125a-5p為miR-125a的成熟體之一,miR-125a加工成miR-125a-5p和miR-125a-3p才能發(fā)揮其生物學(xué)功能,已經(jīng)研究證實(shí)miR-125a-5p在胃癌中參與HER-2信號(hào)通路的調(diào)控,本研究旨在更加深入的探討miR-125a-5p在胃癌中的功能及可能機(jī)制。二、研究目的我們的目的是闡明miR-125a-5p轉(zhuǎn)染的胃癌AGS細(xì)胞對(duì)HUVECs增殖、遷移能力等生物學(xué)行為,研究裸鼠成瘤模型中腫瘤生長(zhǎng)的影響及機(jī)制研究,探討miRNA-125a-5p在人胃癌組織中的表達(dá)并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)及臨床意義。三、研究?jī)?nèi)容1.生物信息學(xué)分析40余種不同胃癌細(xì)胞系中miR-125a DNA拷貝數(shù)情況;qRT-PCR驗(yàn)證分析胃癌細(xì)胞系SGC-7901、AGS、BGC-823中miR-125a-5p的表達(dá)情況；qRT-PCR、Western blot和ELISA分別被用來檢測(cè)miR-125a-5p mimics和inhibitors轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后胞內(nèi)VEGF-A的mRNA、蛋白水平以及培養(yǎng)液中的VEGF-A濃度；Lucifease assay被用來驗(yàn)證VEGF-A是否為miR-125a-5p的靶基因。2.將miR-125a-5p mimics和miR-125a-5p inhibitors轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)。CCK-8和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及體外小管形成實(shí)驗(yàn)被分別用來檢測(cè)miR-125a-5p轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞對(duì)HUVECs細(xì)胞的增殖、遷移及小管形成能力的影響;MK-2206 2HCI (Akt活性抑制劑)被用來檢測(cè)miR-125a-5p對(duì)VEGF-A下游信號(hào)通路的影響。3. 構(gòu)建AGS胃癌細(xì)胞裸鼠成瘤模型后,qRT-PCR檢測(cè)腫瘤組織中miR-125a-5p及VEGF-A的mRNA表達(dá)水平;Western blot和IHC檢測(cè)腫瘤組織中VEGF-A蛋白表達(dá)水平;IHC檢測(cè)移植瘤組織中的CD31表達(dá)狀況(微血管)。4. qRT-PCR檢測(cè)73例胃癌標(biāo)本中miR-125a-5p表達(dá)水平。IHC檢測(cè)組織標(biāo)本中VEGF-A、HER、Ki-67、E-cadherin表達(dá)水平以及CD31的表達(dá)狀況,并分析其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性,并做回顧性分析。5. 利用生物信息學(xué)分析胃癌中與VEGF-A表達(dá)相關(guān)的miRNAs。四、研究結(jié)果1.生物信息學(xué)資料顯示,各細(xì)胞系中miR-125a的DNA拷貝數(shù)差異較大。RT-PCR結(jié)果顯示SGC-7901、AGS、BGC-823中miR-125a-5p表達(dá)均低于正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1(p0.05)。miR-125a-5p mimics轉(zhuǎn)染AGS可降低VEGF-AmRNA和蛋白表達(dá),相對(duì)于對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)；而miR-125a-5pinhibitors轉(zhuǎn)染AGS可使VEGF-A mRNA和蛋白表達(dá)增高,相對(duì)于對(duì)照組也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)VEGF-A可能是miR-125a-5p的靶基因,而Lucifease assay驗(yàn)證了miR-125a-5p可以結(jié)合VEGF-A的3'UTR并抑制其表達(dá)。2.將miR-125a-5p mimics和inhibitors轉(zhuǎn)染的AGS與HUVECs共培養(yǎng)。功能學(xué)分析顯示,miR-125a-5p mimics可減少AGS細(xì)胞VEGF-A分泌,降低HUVECs增殖、遷移以及小管形成能力：而miR-125a-5p inhibitors增加AGS細(xì)胞VEGF-A分泌,增強(qiáng)HUVECs增殖、遷移以及小管形成能力,且Akt抑制劑可以逆轉(zhuǎn)高濃度VEGF-A帶來的這種增強(qiáng)效應(yīng)(p0.05)。3.我們成功使用AGS細(xì)胞構(gòu)建胃癌BALB/C裸鼠移植瘤模型,待瘤體長(zhǎng)至50mm3時(shí),在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組瘤中和瘤周分別注射Control agomir和miR-125a-5p agomir 4周,結(jié)果顯示,對(duì)照組平均移植瘤重及體積均比實(shí)驗(yàn)組大,兩者存在顯著差異(P值均0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示對(duì)照組腫瘤組織中miR-125a-5p表達(dá)量比實(shí)驗(yàn)組腫瘤中表達(dá)量低(p0.05),同時(shí)Western blot顯示VEGF-A表達(dá)量高(p0.05),微血管密度分析顯示MVD與VEGF-A表達(dá)成正相關(guān)(r=0.5495),與miR-125a-5p表達(dá)成負(fù)相關(guān)(r=-0.7419)。4.73例胃腺癌組織標(biāo)本分析顯示,腫瘤組織較癌旁正常組織而言miR-125a-5p表達(dá)降低,其表達(dá)量與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.019)、臨床分期(P=0.001)、MVD (P=0.002)、HER-2表達(dá)(P=0.007)、VEGF-A表達(dá)(P=0.001)相關(guān)。對(duì)VEGF-A的表達(dá)進(jìn)行量化分析發(fā)現(xiàn),VEGF-A表達(dá)與miR-125a-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5382)、與MVD呈正相關(guān)(r=0.7226)：與此同時(shí)miR-125a-5p表達(dá)與MVD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4554)。最后生存分析顯示,低表達(dá)miR-125a-5p、高表達(dá)VEGF-A、高M(jìn)VD均不利于預(yù)后,對(duì)miR-125a-5p進(jìn)行meta-analysis后發(fā)現(xiàn)其為獨(dú)立預(yù)后因素。5. 生物信息學(xué)分析篩選,let-7c、miR-100、miR-143與VEGF-A表達(dá)成負(fù)相關(guān)(r均0.4,p值均0.05)。而let-7g、miR-16-1、miR-15b、miR-126、miR-30b、 miR-191、miR-455、miR-200c、miR-500a與VEGF-A表達(dá)成正相關(guān)(r均0.4,p值均0.05)。五、研究結(jié)論1. miR-125a-5p通過靶向調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞VEGF-A的分泌影響腫瘤血管新生。2. miR-125a-5p agomir通過負(fù)向調(diào)節(jié)VEGF-A的分泌抑制腫瘤生長(zhǎng),是胃癌的潛在治療靶點(diǎn)。3. miR-125a-5p在人胃癌中表達(dá)降低,且與VEGF-A表達(dá)負(fù)相關(guān),影響血管新生,不利于患者預(yù)后。4. 對(duì)胃癌中與VEGF-A表達(dá)相關(guān)的miRNA做出了初步篩選,為后期研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this study , we study the role of miR - 125a - 5p in gastric cancer and its clinical significance . The aim of this study is to investigate the expression of miR - 125a - 5p in gastric cancer and its clinical significance . The aim of this study is to investigate the expression of miR - 125a - 5p in gastric cancer and its clinical significance .
qRT - PCR , Western blot and ELISA were used to detect the mRNA , protein level of VEGF - A and VEGF - A concentration in the culture medium after transfection with miR - 125a - 5p and inhibitors .
The effects of miR - 125a - 5p and miR - 125a - 5p on the proliferation , migration and the formation of small - tube formation were investigated . The effects of miR - 125a - 5p on the proliferation , migration and small - tube formation were investigated . The expression levels of miR - 125a - 5p and VEGF - A in tumor tissues were detected by qRT - PCR . The expression level of VEGF - A , HER , Ki - 67 , E - cadherin and the expression of CD31 were detected by IHC in 73 gastric cancer specimens . The results showed that the expression of miR - 125a - 5p was lower than that of normal gastric mucosa epithelial cells ( P0.05 ) .
The expression of miR - 125a - 5p was significantly correlated with the expression of miR - 125a - 5p ( r = - 0.7419 ) . The expression of miR - 125a - 5p was negatively correlated with the expression of miR - 125a - 5p ( r = - 0.7419 ) . The expression of miR - 125a - 5p was negatively correlated with the expression of miR - 125a - 5p ( r = - 0.5382 ) . Screening , let - 7c , miR - 100 , miR - 143 were negatively correlated with VEGF - A ( r = 0.4 , p < 0.05 ) . However , let - 7g , miR - 16 - 1 , miR - 15b , miR - 126 , miR - 30b , miR - 191 , miR - 455 , miR - 200a , and miR - 500 were positively correlated with VEGF - A ( r = 0.4 , p - value 0.05 ) . 5 . Conclusion 1.miR - 125a - 5p is a potential therapeutic target for gastric cancer . miR - 125a - 5p is a potential therapeutic target for gastric cancer by targeting the secretion of VEGF - A in gastric cancer cells . The preliminary screening of miRNA related to the expression of VEGF - A in gastric cancer lays the foundation for later research .

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：1699935